萬(wàn) 誠(chéng)，李蕾嘉，熊 雪，羅文敏，王 瑩

（貴州省生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009）

姬松茸（Agricus blazei Murrill）屬于蘑菇亞綱（Agricomycetidae） 蘑菇目（Agaricales） 蘑菇科（A－garicaceae） 蘑菇屬（Agaricus），又名巴西蘑菇、小松菇、太陽(yáng)菇、巴西蘑菇、柏拉氏蘑菇[1]。原產(chǎn)于巴西，由于姬松茸具有濃郁的杏仁香味，菌蓋嫩，菌柄脆，美味可口，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、糖類物質(zhì)和多種氨基酸，在巴西圣保羅地區(qū)被稱為“上帝的蘑菇”[1]。自1992年福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從日本成功引種以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)姬松茸進(jìn)行了大量研究，尤其是近幾年，姬松茸的生物活性研究發(fā)展迅猛，并有一定成效[2]。尤其發(fā)現(xiàn)了其多糖具有抗疲勞、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗炎、保肝等作用[3]。然而，姬松茸的育種工作仍存在雜交育種周期長(zhǎng)、種質(zhì)資源有限、缺乏定向育種關(guān)鍵技術(shù)等難題[4]，姬松茸DNA指紋圖譜的研究也基本停留在2012年的研究水平[5-8]。因此，研究利用RAPD、ISSR、酯酶同工酶技術(shù)對(duì)11個(gè)不同來(lái)源的姬松茸菌株進(jìn)行遺傳多樣性研究，分析比較其親緣關(guān)系，為姬松茸的優(yōu)良品種選育以及進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

共收集姬松茸菌株11個(gè)，名稱與來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試菌株及來(lái)源情況Tab.1 Strains and sources

1.1.2 培養(yǎng)基

用于姬松茸菌絲培養(yǎng)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA） 綜合培養(yǎng)基配方（1 L）：馬鈴薯200 g、蛋白胨 5 g、蔗糖 20 g、瓊脂 20 g，水 1 000 mL，120℃滅菌 30 min。

1.1.3 主要試劑

用于酯酶同工酶試驗(yàn)的藥品有：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、固藍(lán)RR鹽均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

用于RAPD與ISSR試驗(yàn)的藥品有：瓊脂糖、核酸染料、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、2×SanTaq PCR Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.4 引物合成

試驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成與提供，擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。

表2 RAPD與ISSR引物序列Tab.2 RAPD and ISSR primer sequences

1.1.5 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自四川蜀科儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀器，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；水平電泳槽、垂直電泳槽、電泳儀均，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自廣州博鷺騰生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

將保存的11個(gè)姬松茸菌種接種于PDA培養(yǎng)基，每個(gè)菌種接種20個(gè)平板，用封口膜包好，24℃避光培養(yǎng)。

1.2.2 菌絲拮抗試驗(yàn)

以培養(yǎng)皿圓心為中心，在同一平板上按“品”字形接種，每個(gè)培養(yǎng)皿接入3種菌株，3次重復(fù)，24℃避光培養(yǎng)，觀察不同菌株間是否產(chǎn)生拮抗反應(yīng)。

1.2.3 DNA提取

取PDA培養(yǎng)基中的姬松茸菌絲0.1 g，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取。

1.2.4 RAPD與ISSR法反應(yīng)體系及電泳

RAPD法PCR擴(kuò)增體系選用25 μL體系[9]：2×SanTaq PCR Mix 12 μL、無(wú) 菌 水 10 μL、引 物 2 μL、DNA 1 μL。PCR 程序?yàn)?94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性1 min，以低于引物溶解溫度（Tm值）5℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 2 min，共 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

ISSR法PCR擴(kuò)增體系選用20 μL體系[10]：2×SanTaq PCR Mix 10 μL、無(wú)菌水 7 μL、引物 2 μL、DNA 1 μL。PCR 程序?yàn)?94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性30 s，以低于引物溶解溫度（Tm值） 5℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

采用1.5%濃度瓊脂糖凝膠檢測(cè)已擴(kuò)增好的片段，用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.5 酯酶同工酶方法及電泳

在NY/T 1097-2006食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法[11-12]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良優(yōu)化。取PDA培養(yǎng)基中的姬松茸菌絲0.2 g，加入1 000 μL樣品提取液（0.4 mol·L-1的Na2HPO4與NaH2PO4）冰浴研磨，在4℃下10 000 r·min-1離心10 min后取上清液備用；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳后再進(jìn)行染色處理。

1.2.6 RAPD與ISSR法數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各泳道在同一位置擴(kuò)增出的強(qiáng)帶或可分辨性較好的弱帶記為“1”，未擴(kuò)增出條帶記為“0”，用NTsys軟件進(jìn)行聚類分析，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA） 構(gòu)建系統(tǒng)樹[13]。

1.2.7 酯酶同工酶法數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

觀察樣品酶帶，計(jì)算酶帶的遷移率Rf，同時(shí)觀察凝膠片，繪制凝膠酶譜，根據(jù)酶譜進(jìn)行讀帶分析，強(qiáng)帶記為“1、1、1”，次強(qiáng)帶記為“0、1、1”，弱帶記為“0、0、1”，無(wú)帶記為“0、0、0”，用NTsys軟件進(jìn)行聚類分析，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA） 構(gòu)建系統(tǒng)樹[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試姬松茸菌株的拮抗分析結(jié)果

不同姬松茸菌株拮抗反應(yīng)統(tǒng)計(jì)及其形態(tài)特征見(jiàn)表3及圖1。

表3 供試姬松茸菌株間的拮抗反應(yīng)Tab.3 Antagonistic effect between Agaricus blazei strains

圖1 部分姬松茸菌株間的拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of some Agaricus blazei strains

由圖1可知，各菌株菌絲生長(zhǎng)隔離型、溝型、隆起型均有表現(xiàn)，11個(gè)供試姬松茸菌株間均存在拮抗反應(yīng)，表明11個(gè)菌株之間的親緣關(guān)系較疏遠(yuǎn)，后續(xù)將利用RAPD、ISSR、酯酶同工酶技術(shù)進(jìn)一步鑒定。

2.2 供試姬松茸菌株的RAPD分析結(jié)果

從20條RAPD引物中篩選出的10條擴(kuò)增條帶較多的引物及其擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表4，引物RAPD-08對(duì)11個(gè)供試姬松茸菌株的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

表4 供試姬松茸菌株的RAPD多態(tài)性分析Tab.4 RAPD polymorphism analysis of Agaricus blazei strains

圖2 引物RAPD-08對(duì)11個(gè)供試姬松茸菌株的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of primer RAPD-08 on 11 tested Agaricus blazei strains

由表4可知，以11個(gè)供試姬松茸菌株的基因組DNA為模板，用篩選出的10條RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出110條DNA片段，其中多態(tài)性條帶數(shù)為88條，多態(tài)性比例為76.9%。由圖2可知，擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度為200 bp～3 000 bp，其遺傳多樣性分析聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 11個(gè)供試姬松茸菌株的RAPD聚類分析結(jié)果Fig.3 RAPD cluster analysis of 11 tested Agaricus blazei strains

由圖3可知，相似系數(shù)在0.65時(shí)，11個(gè)供試姬松茸菌株被分為三大群類，第一大類包括姬松茸51119與姬松茸51242；第二大類在相似系數(shù)0.72時(shí)又分為2個(gè)亞類，第一亞類由姬松茸51148、姬松茸51237、姬松茸-4、姬松茸SWS-JS05、姬松茸SWS-JS07和姬松茸SWS-JS08組成，第2亞類為姬松茸52195和姬松茸SWS-JS06；第三大類僅有姬松茸51392。

2.3 供試姬松茸菌株的ISSR分析結(jié)果

從20條ISSR引物中篩選出的12條擴(kuò)增條帶較多的引物及其擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表5，引物ISSR-02對(duì)11個(gè)供試姬松茸菌株的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。

表5 供試姬松茸菌株的ISSR多態(tài)性分析Tab.5 ISSR polymorphism analysis of Agaricus blazei strains

由表5可知，以11個(gè)供試姬松茸菌株的基因組DNA為模板，用篩選出的12條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出122條DNA片段，其中多態(tài)性條帶為87條，多態(tài)性比例為70%，由圖4可知，擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度為200 bp～3 000 bp，其遺傳多樣性分析聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 引物ISSR-02對(duì)11個(gè)供試姬松茸菌株的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of primer ISSR-02 on 11 tested Agaricus blazei strains

圖5 11個(gè)供試姬松茸菌株的ISSR聚類分析結(jié)果Fig.5 ISSR cluster analysis of 11 tested Agaricus blazei strains

由圖5可知，相似系數(shù)在0.79時(shí)，11個(gè)供試姬松茸菌株被分為三大群類，第一大類包括姬松茸51119與姬松茸51242；第二大類在相似系數(shù)0.82時(shí)又分為2個(gè)亞類，第一亞類由姬松茸51148、姬松茸51237、姬松茸-4、姬松茸SWS-JS07、姬松茸SWS-JS05、姬松茸SWS-JS06和姬松茸SWS-JS08組成，第2亞類僅有姬松茸52195；第三大類僅有姬松茸51392。

2.4 供試姬松茸菌株的酯酶同工酶分析結(jié)果

根據(jù)酯酶同工酶電泳結(jié)果繪制成的酯酶條帶譜見(jiàn)圖6。

由圖6可知，在11個(gè)供試姬松茸菌株中共檢測(cè)到83條酶帶，其中最少的為6條，最多的為9條，酯酶條帶表現(xiàn)出顯著的強(qiáng)弱性，遷移率Rf介于0.27～1.00，說(shuō)明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性，其遺傳多樣性分析聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖6 11個(gè)供試姬松茸菌株的酯酶同工酶電泳圖譜Fig.6 Esterase isozyme patterns of 11 tested Agaricus blazei strains

圖7 11個(gè)供試姬松茸菌株的酯酶同工酶聚類分析結(jié)果Fig.7 Cluster analysis of esterase isozymes of 11 tested Agaricus blazei strains

由圖7可知，在相似系數(shù)在0.76時(shí)，11個(gè)供試姬松茸菌株被分為三大群類，第一大類包括姬松茸51119、姬松茸51237與姬松茸51242；第二大類在相似系數(shù)0.79時(shí)又分為2個(gè)亞類，第一亞類由姬松茸51148、姬松茸SWS-JS05和姬松茸52195組成，第2亞類由姬松茸-4、姬松茸SWS-JS07、姬松茸SWS-JS06和姬松茸SWS-JS08組成；第三大類僅有姬松茸51392。

2.5 11個(gè)供試姬松茸菌株的聚類分析結(jié)果

基于3種方法的遺傳多樣性聚類分析（圖3、圖5、圖7） 中，RAPD法各菌株的相似系數(shù)介于0.476 7～0.918 6，ISSR法各菌株的相似系數(shù)介于0.631 6～0.907 9，酯酶同工酶法各菌株的相似系數(shù)介于0.629 6～0.925 9。RAPD、ISSR、酯酶同工酶法菌株之間相似系數(shù)分別在0.65、0.79、0.76時(shí)，均把11個(gè)供試姬松茸菌株劃分為三大類群，RAPD與ISSR法將姬松茸51119和姬松茸51242為一類，姬松茸51392為一類，其余菌株為一類；酯酶同工法略有不同，將姬松茸51119、姬松茸51242和姬松茸51237歸為一類，其余與RAPD與ISSR結(jié)果相同。在11個(gè)供試姬松茸菌株中，姬松茸-4與姬松茸51237親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，相似系數(shù)為0.476 7；姬松茸-4與姬松茸SWS-JS07親緣關(guān)系最近，相似系數(shù)為0.925 9。

綜合10個(gè)RAPD引物、12個(gè)ISSR引物和酯酶同工酶對(duì)11個(gè)供試姬松茸菌株的多態(tài)性分析結(jié)果，共計(jì)獲得189條多態(tài)性條帶用于構(gòu)建UPMGA聚類樹狀圖見(jiàn)圖8。

圖8 11個(gè)供試姬松茸菌株的RAPD、ISSR和酯酶同工酶聚類分析結(jié)果Fig.8 RAPD,ISSR and EST cluster analysis results of 11 tested Agaricus blazei strains

由圖8可知，聚類分析后各菌株間相似系數(shù)在0.619 0～0.899 5，在相似系數(shù)為0.75時(shí)，11個(gè)供試姬松茸菌株被劃分為三大類群，第一大類包括姬松茸51119和姬松茸51242；第二大類在相似系數(shù)0.79時(shí)又分為2個(gè)亞類，第一亞類由姬松茸51148、姬松茸51237、姬松茸-4、姬松茸SWS-JS07、姬松茸SWS-JS08和姬松茸SWS-JS05組成，第2亞類由姬松茸52195和姬松茸SWS-JS06組成；第三大類僅有姬松茸51392。

3 討論與結(jié)論

由于每種分子標(biāo)記技術(shù)都能根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域的不同反映樣品的遺傳多樣性，其中RAPD法是以單一的寡核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR非定點(diǎn)擴(kuò)增，操作方法簡(jiǎn)單，但RAPD穩(wěn)定性較差，易產(chǎn)生非特異性條帶[15]；ISSR法是在1個(gè)～4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列外，還在引物的5’端或3’端加上2個(gè)～4個(gè)非重復(fù)的錨定簡(jiǎn)并堿基，操作方法簡(jiǎn)單，退火溫度較高，具有較好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和多態(tài)性[16-17]。因此，對(duì)樣品進(jìn)行遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育樹等研究時(shí)，應(yīng)盡可能選用多種標(biāo)記法，以避免單一類分子標(biāo)記存在的片面性[18]。

本研究分別采用10條RAPD引物、12條ISSR引物和酯酶同工酶對(duì)不同溯源的11份姬松茸菌株進(jìn)行遺傳距離以及遺傳多樣性的分析。RAPD、ISSR兩種分子標(biāo)記的多態(tài)性比例分別為76.9%與70.0%，反映出11個(gè)供試姬松茸菌株在種間、種內(nèi)存在較高的遺傳多樣性。3種方式的聚類均能將不同來(lái)源的供試姬松茸菌株區(qū)分開，并區(qū)分為三大類。為了避免單一類標(biāo)記法的偶然與片面性，研究又基于RAPD、ISSR和酯酶同工酶3種標(biāo)記的結(jié)果分析，構(gòu)建供試姬松茸菌株UPMGA聚類分析圖。將11個(gè)供試姬松茸劃分為三大類，姬松茸51119和姬松茸51242為一類，姬松茸51392為一類，其余菌株為一類。試驗(yàn)為姬松茸雜交選育親本奠定了理論基礎(chǔ)，為姬松茸菌株優(yōu)良農(nóng)藝性狀的良種選育提供了參考和依據(jù)，有利于姬松茸種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)。

王守現(xiàn)等[19]研究同時(shí)利用酯酶同工酶、RAPD與ISSR法對(duì)6個(gè)不同灰樹花（Polyporus frondosus） 菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，將6個(gè)灰樹花菌株劃分為三大類，也同時(shí)驗(yàn)證了RAPD和ISRR分析結(jié)果與酯酶同工酶分析的結(jié)果一致。從研究結(jié)果看，在樣品數(shù)較少的情況下，單獨(dú)采用RAPD、ISSR和酯酶同工酶法3種方式的聚類分析均能將樣品區(qū)分開，并且所劃分的類群相差極小，采用綜合分析法也與單一標(biāo)記法的結(jié)果幾乎一致，但也存在著一定的偶然性與片面性?；蛟S在樣品數(shù)量逐漸增加至足夠多時(shí)，分類的結(jié)果也會(huì)存在差異，則需要更多的標(biāo)記方法以及更多的引物種類綜合聚類分析才能更加全面。