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        廣州市九里香白粉病病原鑒定

        2021-10-14 10:16:04宋曉兵凌金鋒彭埃天崔一平陳霞
        熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:九里香白粉進(jìn)化樹

        宋曉兵 凌金鋒 彭埃天 崔一平 陳霞

        (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東廣州510640)

        九里香[Murraya paniculata(L.)Jack],別名千里香,為蕓香科九里香屬植物,分布于廣東、海南、廣西、福建等地,我國華南地區(qū)廣泛栽培,常被作為園林風(fēng)景樹、綠化植物、盆景等[1]。九里香病蟲害較少發(fā)生,得益于九里香葉或根中的香豆素、黃酮、植物精油、萜類化合物具有較好的抗病原菌和昆蟲拒食活性[2]。研究發(fā)現(xiàn),九里香作為蕓香科屬的植物也受柑橘木虱傳播的黃龍病菌侵染,但并不產(chǎn)生明顯的癥狀,也稱之為柑橘黃龍病菌的隱癥寄主[3],是柑橘黃龍病抗性育種研究的潛在資源;九里香對柑橘木虱的吸引效果顯著優(yōu)于砂糖橘、貢柑、椪柑等柑橘類果樹[4-6],也是目前人工飼養(yǎng)柑橘木虱的天然優(yōu)勢寄主。

        2020年4 月,筆者在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所大豐試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)九里香白粉病暴發(fā),為探明九里香白粉病的暴發(fā)成因,結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對九里香白粉病的病原菌進(jìn)行鑒定,以期為九里香白粉病的綜合防治提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品

        病害標(biāo)本采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所大豐試驗(yàn)基地。

        1.1.2 試劑

        AxyPrep基因組DNA小量試劑盒購自Axygen Scientific Inc.;2×EasyTaq? PCR SuperMix(-dye)PCR擴(kuò)增試劑盒購自TransGen Biotech Co.,Ltd.;引物合成及PCR產(chǎn)物測序服務(wù)均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

        1.2 方法

        1.2.1 病害癥狀及病原菌形態(tài)觀察

        田間觀察九里香白粉病的發(fā)病癥狀,包括病斑的形狀、大小、色澤及病害對九里香植物的危害情況[7]。用滅菌針挑取新鮮病葉表面的白色粉層少許,做成臨時玻片,用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌的形態(tài)特征。

        1.2.2 病原菌分子鑒定

        用滅菌金屬匙刮取九里香葉面的白色粉狀物,液氮研磨,采用DNA試劑盒法提取病原菌DNA。分別選取擴(kuò)增真菌ITS和LSU rDNA D1/D2區(qū)域的PCR通用引物,ITS(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3',ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[8]和LSU rDNA(NL1:5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3',NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)[9],以提取的病原菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):模板1.0 μL,2×EasyTaq?PCR SuperMix 12.5 μL,上 下游引物 各1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò) 增 程 序:95℃預(yù) 變 性5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃50 s,35個 循 環(huán);72℃延 伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物,檢測后直接送公司測序。采用DNA Star軟件對病原菌的ITS和LSU rDNA序列進(jìn)行分析,并分別在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,利用MEGA 6.0進(jìn)行序列的同源性分析,鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,確定病原菌的分類地位。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 九里香白粉病癥狀

        田間癥狀觀察九里香白粉病發(fā)現(xiàn),白粉病主要危害九里香的葉片、葉柄和嫩枝,病菌集中發(fā)生在葉片正面。葉片發(fā)病,初期先形成近圓形的白霉斑,有輻射狀銀白色的菌絲,然后逐步蔓延至整個葉片,病斑上出現(xiàn)一層白粉,呈現(xiàn)大小不一的白粉病斑;嫩枝發(fā)病,枝條發(fā)育停滯,嫩葉扭曲畸形、出現(xiàn)不均勻黃斑,隨著病情的加重,整個嫩枝的葉片逐步萎黃、皺縮、卷曲甚至凋謝,最后葉片脫落、枝條枯死;花序發(fā)病,表面著生一層白粉,影響結(jié)實(shí),果實(shí)易脫落。病害多發(fā)生于九里香嫩葉、嫩芽、嫩枝及花序,嚴(yán)重者也可為害老葉(圖1)。

        圖1 九里香白粉病田間癥狀

        2.2 病原菌形態(tài)特征

        取適量白粉菌粉制成玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察,可看到大量的分生孢子,分生孢子多數(shù)橢圓形,中間膨大、兩端圓、單胞、無色。分生孢子長30.32~40.25 μm,寬13.56~21.33 μm;圓柱形足細(xì)胞長27.65~46.53 μm(圖2)。

        圖2 九里香白粉病病原菌形態(tài)特征

        2.3 病原菌分子鑒定

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證引起九里香白粉病病原菌所屬的分類地位,選用ITS和LSU rDNA D1/D2區(qū)兩個檢測引物對提取的九里香白粉病病原菌基因組進(jìn)行檢測,經(jīng)過PCR和測序后分別獲得644 bp的ITS片段和617 bp的LSU rDNA片段,將測序所得序列進(jìn)行BLAST在線比對,并分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

        BLAST搜索比對顯示,九里香白粉病病原菌的ITS序列與GenBank中已登錄的Erysiphe quer‐cicola多 個 序 列(MH137255.1、LC128427.1、MH333267.1)的同源性均達(dá)到99.84%,九里香白粉病病原菌的LSU rDNA D1/D2區(qū)序列與GenBank中已登錄的Erysiphe quercicola多個序列(MN165985.1、MH561927.1、LC306873.1)的同源性均為100%。病原菌ITS片段的聚類結(jié)果(圖3)表明,九里香白粉病病原菌(Erysiphestrain JLX2020)的ITS序 列 與Erysiphe quercicola多個序列歸為一類,而柑橘炭疽病菌(Colletot‐richum gloeosporioides)的兩個菌株(AJ311884.1、JN390897.1)則歸為另一個聚類。病原菌LSU rDNA片段的聚類結(jié)果(圖4)表明,九里香白粉病病原菌(Erysiphestrain JLX2020)的LSU rDNA序列與Erysiphe quercicola多個序列歸為一類,而柑橘炭疽病菌的兩個菌株(CQ495616.1、KM278589.1)則歸為另一個聚類。

        圖3 基于ITS序列構(gòu)建的九里香白粉病菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

        圖4 基于LSU rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的九里香白粉病菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

        基于病原菌的無性態(tài)形態(tài)特征與分子生物學(xué)的同源性分析,可以將九里香白粉病的病原菌鑒定為子囊菌門(Ascomycota),錘舌菌綱(Leo‐tiomycetes),白粉菌目(Erysiphales),白粉菌科(Erysiphaceae),白粉菌屬(Erysiphe)的E.quercicola。

        3 討論

        白粉菌具有專性寄生的生物學(xué)特性,因而寄主植物相對固定,但存在病原菌的宿主轉(zhuǎn)移[10-11]。前人報道廣西九里香白粉病由白粉菌(Oidiumsp.)引起[12],近來一些研究認(rèn)為,應(yīng)該將Oidium重新分類至Erysiphe、Golovinomyces或Podos‐phaera[13]。研究發(fā)現(xiàn),海南地區(qū)的橡膠樹、馬占相思、九里香和紅木白粉病病原菌的ITS序列之間相似性均在99%以上,與(Erysiphe quercicola)的ITS序列也具有99%以上的同源性[14]。本研究中的廣州市九里香白粉病證實(shí)由Erysiphe querci‐cola引起,與前人報道相一致。

        最新的白粉菌分類系統(tǒng)中,白粉菌科主要分為5個族,包含16個有性型屬和2個無性型屬[15]。根據(jù)報道,中國的22個省、5個自治區(qū)和2個直轄市均有白粉病發(fā)生,共計13個有性型屬328種及44變種[16]。白粉菌形態(tài)鑒定過程中,由于一些種類間在形態(tài)上存在過渡類型,使得一些種的界定比較困難。本研究采用真菌ITS和LSU rDNA雙鑒別基因?qū)σ鹁爬锵惆追鄄〉牟≡M(jìn)行鑒定,增加對病原菌所屬種類劃分的準(zhǔn)確性;通過病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,確定引起廣州市九里香白粉病的病原菌為Erysiphe quercicola。氣溫反復(fù)、陰雨天氣是誘發(fā)九里香白粉病的重要因素,需要及時采用殺菌劑代森錳鋅、三唑酮及時預(yù)防或治療。

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