宋曉兵 凌金鋒 彭埃天 崔一平 陳霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東廣州510640)

九里香［Murraya paniculata（L.）Jack］，別名千里香，為蕓香科九里香屬植物，分布于廣東、海南、廣西、福建等地，我國(guó)華南地區(qū)廣泛栽培，常被作為園林風(fēng)景樹(shù)、綠化植物、盆景等［1］。九里香病蟲(chóng)害較少發(fā)生，得益于九里香葉或根中的香豆素、黃酮、植物精油、萜類(lèi)化合物具有較好的抗病原菌和昆蟲(chóng)拒食活性［2］。研究發(fā)現(xiàn)，九里香作為蕓香科屬的植物也受柑橘木虱傳播的黃龍病菌侵染，但并不產(chǎn)生明顯的癥狀，也稱(chēng)之為柑橘黃龍病菌的隱癥寄主［3］，是柑橘黃龍病抗性育種研究的潛在資源；九里香對(duì)柑橘木虱的吸引效果顯著優(yōu)于砂糖橘、貢柑、椪柑等柑橘類(lèi)果樹(shù)［4-6］，也是目前人工飼養(yǎng)柑橘木虱的天然優(yōu)勢(shì)寄主。

2020年4 月，筆者在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所大豐試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)九里香白粉病暴發(fā)，為探明九里香白粉病的暴發(fā)成因，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)九里香白粉病的病原菌進(jìn)行鑒定，以期為九里香白粉病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

病害標(biāo)本采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所大豐試驗(yàn)基地。

1.1.2 試劑

AxyPrep基因組DNA小量試劑盒購(gòu)自Axygen Scientific Inc.；2×EasyTaq? PCR SuperMix（-dye）PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自TransGen Biotech Co.，Ltd.；引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序服務(wù)均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病害癥狀及病原菌形態(tài)觀察

田間觀察九里香白粉病的發(fā)病癥狀，包括病斑的形狀、大小、色澤及病害對(duì)九里香植物的危害情況［7］。用滅菌針挑取新鮮病葉表面的白色粉層少許，做成臨時(shí)玻片，用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌的形態(tài)特征。

1.2.2 病原菌分子鑒定

用滅菌金屬匙刮取九里香葉面的白色粉狀物，液氮研磨，采用DNA試劑盒法提取病原菌DNA。分別選取擴(kuò)增真菌ITS和LSU rDNA D1/D2區(qū)域的PCR通用引物，ITS（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）［8］和LSU rDNA（NL1：5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）［9］，以提取的病原菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板1.0 μL，2×EasyTaq?PCR SuperMix 12.5 μL，上 下游引物 各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò) 增 程 序：95℃預(yù) 變 性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，35個(gè) 循 環(huán)；72℃延 伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，檢測(cè)后直接送公司測(cè)序。采用DNA Star軟件對(duì)病原菌的ITS和LSU rDNA序列進(jìn)行分析，并分別在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0進(jìn)行序列的同源性分析，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，確定病原菌的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 九里香白粉病癥狀

田間癥狀觀察九里香白粉病發(fā)現(xiàn)，白粉病主要危害九里香的葉片、葉柄和嫩枝，病菌集中發(fā)生在葉片正面。葉片發(fā)病，初期先形成近圓形的白霉斑，有輻射狀銀白色的菌絲，然后逐步蔓延至整個(gè)葉片，病斑上出現(xiàn)一層白粉，呈現(xiàn)大小不一的白粉病斑；嫩枝發(fā)病，枝條發(fā)育停滯，嫩葉扭曲畸形、出現(xiàn)不均勻黃斑，隨著病情的加重，整個(gè)嫩枝的葉片逐步萎黃、皺縮、卷曲甚至凋謝，最后葉片脫落、枝條枯死；花序發(fā)病，表面著生一層白粉，影響結(jié)實(shí)，果實(shí)易脫落。病害多發(fā)生于九里香嫩葉、嫩芽、嫩枝及花序，嚴(yán)重者也可為害老葉（圖1）。

圖1 九里香白粉病田間癥狀

2.2 病原菌形態(tài)特征

取適量白粉菌粉制成玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察，可看到大量的分生孢子，分生孢子多數(shù)橢圓形，中間膨大、兩端圓、單胞、無(wú)色。分生孢子長(zhǎng)30.32～40.25 μm，寬13.56～21.33 μm；圓柱形足細(xì)胞長(zhǎng)27.65～46.53 μm（圖2）。

圖2 九里香白粉病病原菌形態(tài)特征

2.3 病原菌分子鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證引起九里香白粉病病原菌所屬的分類(lèi)地位，選用ITS和LSU rDNA D1/D2區(qū)兩個(gè)檢測(cè)引物對(duì)提取的九里香白粉病病原菌基因組進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序后分別獲得644 bp的ITS片段和617 bp的LSU rDNA片段，將測(cè)序所得序列進(jìn)行BLAST在線(xiàn)比對(duì)，并分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

BLAST搜索比對(duì)顯示，九里香白粉病病原菌的ITS序列與GenBank中已登錄的Erysiphe quer‐cicola多 個(gè) 序 列（MH137255.1、LC128427.1、MH333267.1）的同源性均達(dá)到99.84%，九里香白粉病病原菌的LSU rDNA D1/D2區(qū)序列與GenBank中已登錄的Erysiphe quercicola多個(gè)序列（MN165985.1、MH561927.1、LC306873.1）的同源性均為100%。病原菌ITS片段的聚類(lèi)結(jié)果（圖3）表明，九里香白粉病病原菌（Erysiphestrain JLX2020）的ITS序 列 與Erysiphe quercicola多個(gè)序列歸為一類(lèi)，而柑橘炭疽病菌（Colletot‐richum gloeosporioides）的兩個(gè)菌株（AJ311884.1、JN390897.1）則歸為另一個(gè)聚類(lèi)。病原菌LSU rDNA片段的聚類(lèi)結(jié)果（圖4）表明，九里香白粉病病原菌（Erysiphestrain JLX2020）的LSU rDNA序列與Erysiphe quercicola多個(gè)序列歸為一類(lèi)，而柑橘炭疽病菌的兩個(gè)菌株（CQ495616.1、KM278589.1）則歸為另一個(gè)聚類(lèi)。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的九里香白粉病菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖4 基于LSU rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的九里香白粉病菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

基于病原菌的無(wú)性態(tài)形態(tài)特征與分子生物學(xué)的同源性分析，可以將九里香白粉病的病原菌鑒定為子囊菌門(mén)（Ascomycota），錘舌菌綱（Leo‐tiomycetes），白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae），白粉菌屬（Erysiphe）的E.quercicola。

3 討論

白粉菌具有專(zhuān)性寄生的生物學(xué)特性，因而寄主植物相對(duì)固定，但存在病原菌的宿主轉(zhuǎn)移［10-11］。前人報(bào)道廣西九里香白粉病由白粉菌（Oidiumsp.）引起［12］，近來(lái)一些研究認(rèn)為，應(yīng)該將Oidium重新分類(lèi)至Erysiphe、Golovinomyces或Podos‐phaera［13］。研究發(fā)現(xiàn)，海南地區(qū)的橡膠樹(shù)、馬占相思、九里香和紅木白粉病病原菌的ITS序列之間相似性均在99%以上，與（Erysiphe quercicola）的ITS序列也具有99%以上的同源性［14］。本研究中的廣州市九里香白粉病證實(shí)由Erysiphe querci‐cola引起，與前人報(bào)道相一致。

最新的白粉菌分類(lèi)系統(tǒng)中，白粉菌科主要分為5個(gè)族，包含16個(gè)有性型屬和2個(gè)無(wú)性型屬［15］。根據(jù)報(bào)道，中國(guó)的22個(gè)省、5個(gè)自治區(qū)和2個(gè)直轄市均有白粉病發(fā)生，共計(jì)13個(gè)有性型屬328種及44變種［16］。白粉菌形態(tài)鑒定過(guò)程中，由于一些種類(lèi)間在形態(tài)上存在過(guò)渡類(lèi)型，使得一些種的界定比較困難。本研究采用真菌ITS和LSU rDNA雙鑒別基因?qū)σ鹁爬锵惆追鄄〉牟≡M(jìn)行鑒定，增加對(duì)病原菌所屬種類(lèi)劃分的準(zhǔn)確性；通過(guò)病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定引起廣州市九里香白粉病的病原菌為Erysiphe quercicola。氣溫反復(fù)、陰雨天氣是誘發(fā)九里香白粉病的重要因素，需要及時(shí)采用殺菌劑代森錳鋅、三唑酮及時(shí)預(yù)防或治療。