向 陽， 胡 鯤*， 方曙光， 朱建國， 柯 軻， 陳 獻

（1.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海201306；2.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海201306；3.上海海洋大學農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；4.微康益生菌（蘇州）股份有限公司，江蘇蘇州215200；5.蘇州宏鰲生物農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇蘇州215200）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模、集約化程度不斷提高，水產(chǎn)動物病害問題也日趨嚴重。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國因病害造成的水產(chǎn)品損失高達408億元（崔利鋒，2020）。加之抗生素耐藥性和化學藥物污染等問題日益凸顯（李炳等，2020；Wu等，2019），利用益生菌防治水產(chǎn)動物疾病、減少經(jīng)濟損失已然成為水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)人員和研究學者關(guān)注的焦點。益生菌可通過定植在水產(chǎn)動物腸道，改善其腸道微生態(tài)環(huán)境，優(yōu)化腸道菌群，從而發(fā)揮其有效作用（張美玲等，2021）。目前，芽孢桿菌類的益生菌在促進水產(chǎn)動物生長、增強機體免疫以及改良水質(zhì)等方面的研究已取得良好進展（吳豪益等，2021）。

凝結(jié)芽孢桿菌是一類既具有產(chǎn)乳酸特性，又同其他芽孢桿菌一樣具有耐高溫特性，兼性厭氧的革蘭氏陽性菌（鄒梅等，2017）。自2013年被正式列入《飼料添加劑品種目錄》以來，凝結(jié)芽孢桿菌已作為益生菌廣泛應用于畜禽水產(chǎn)等行業(yè)，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可提高飼料養(yǎng)分的利用率（Fu等，2021），促進其蛋白質(zhì)和脂類代謝流轉(zhuǎn)（吳正可，2021），提高生長性能和機體抗病力（李佳徽，2021），改善腸道菌群結(jié)構(gòu)?；诖?，本研究在團頭魴飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌，觀察對其臟器組織形態(tài)和血清生化指標的影響，為凝結(jié)芽孢桿菌等益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 凝結(jié)芽孢桿菌制劑BC66（1000 cfu/g）由微康益生菌（蘇州）股份有限公司提供，于2020年7～8月在江蘇無錫開展。

1.2 試驗設(shè)計 試驗選取體重（26.5±0.5）g的健康團頭魴幼苗180尾，隨機分為2組，每組3個重復，每個重復30尾。對照組投喂基礎(chǔ)日糧（表1），試驗組為基礎(chǔ)日糧+0.15‰的凝結(jié)芽孢桿菌BC66制劑，試驗30 d。試驗期間以重復為單位，每天投喂3次。試驗期水溫控制在26～30℃，pH為7.0～8.0，溶氧保持在5 mg/L以上。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 試驗方法 解剖取樣觀察：于試驗初期、末期分別在每個重復選3尾魚解剖，對比觀察腹腔及腸道狀況，并取完整腸道、腎臟和肝胰臟樣本。

將樣本用0.65%的生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，取1～2 cm的前腸和后腸，以10%的甲醛溶液固定備用。另外，再在每個重復分別取3尾，尾靜脈取血6 mL，均分為2等份。一份放入抗凝管中，進行血液常規(guī)參數(shù)測定；另一份血液于8000 r/min、4℃的條件下離心5 min，制備得到的血清于-20℃凍存?zhèn)溆?，用于測定血清生化指標。

組織病理切片觀察：各組樣本經(jīng)10%甲醛溶液固定24 h后，水洗20 min，再用梯度酒精脫水。脫水后的組織用二甲苯處理至完全透明后，用石蠟浸泡包埋、切片，厚度設(shè)置為4～5μm。經(jīng)HE染色后，用中性樹膠封片，在100×10倍光學顯微鏡下觀察。

血液常規(guī)參數(shù)：采用全自動動物血液細胞分析儀（邁瑞B(yǎng)C-5300VEt）測定血紅蛋白濃度（HGB）和紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）等，所用試劑購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

血清生化指標：采用分析試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）測定谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總 蛋 白（TP）、白 蛋 白（ALP）、尿 素 氨（BUN）等指標，詳細操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC66對團頭魴臟器組織形態(tài)的影響 試驗結(jié)果表明，試驗組投喂凝結(jié)芽孢桿菌后，腹腔充血狀況極大改善，腸道壁毛細血管充血現(xiàn)象消失，韌性增強。試驗末期試驗組腹腔顏色自然，腹腔充血狀況消失，腸道韌性強。

進一步對各臟器組織病理切片（100×10）進行對比發(fā)現(xiàn)（圖1～4，A為對照組，B為試驗組），試驗組前、后腸道組織更緊密，腸上皮細胞溶解現(xiàn)象明顯減少。投喂凝結(jié)芽孢桿菌的試驗組團頭魴肝臟、腎臟組織緊密性增強，分布更為均勻，體現(xiàn)出更好的代謝及排泄功能。

圖1 前腸組織切片（100＊10）

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC66對團頭魴血液常規(guī)指標的影響 如表2所示，日糧添加凝結(jié)芽孢桿菌BC66后，血紅蛋白濃度較試驗初期提升了20.6%，較末期對照組提升了12.3%。紅細胞數(shù)量較試驗初期降低了31.3%，比末期對照組高出36.1%。白細胞數(shù)量較試驗初期提升了41.1%，比末期對照組高出11.5%。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌BC66對團頭魴血常規(guī)指標的影響

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC66對團頭魴血清生化指標的影響 如表3所示，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌后，總蛋白、白蛋白含量較試驗初期分別提升了32.6%、26.0%，尿素氮指標較試驗初期降低了28.8%。谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶較試驗初期分別降低了8.4%、15.0%，堿性磷酸酶指標試驗前后基本無變化。

表3 凝結(jié)芽孢桿菌對團頭魴血清生化指標的影響

圖3 肝臟組織切片（100×10）

圖4 腎臟組織切片（100×10）

3 討論

腸道、肝臟和腎臟分別是動物進行消化、代謝和排泄的主要場所，各組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其生理功能聯(lián)系緊密。申維維、蔣磊等（2021）研究證實，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可改善肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，起到促進生長的作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖應用中，關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌改善魚類腸道結(jié)構(gòu)的報道較少見，大多集中在凝結(jié)芽孢桿菌對腸道菌群的影響（匡群等，2013）。單金峰等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌可顯著增加青蝦腸道微生物區(qū)系。凝結(jié)芽孢桿菌可降低虹鱒腸道變形菌門比例，提升厚壁菌門、擬桿菌門比例。反映出凝結(jié)芽孢桿菌在改善水產(chǎn)動物腸道微生物屏障方面有促進作用。正常的腸道微生物屏障對腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用，可通過排擠有害菌，分泌抑菌素，減少腸上皮損傷。本研究飼喂凝結(jié)芽孢桿菌后解剖觀察發(fā)現(xiàn)，團頭魴腹腔充血狀況極大改善，腸道壁毛細血管充血現(xiàn)象消失，韌性增強。腸道組織也更緊密平滑、分布規(guī)則，上皮細胞無溶解現(xiàn)象，顯示出改善腸道絨毛結(jié)構(gòu)的效果。說明凝結(jié)芽孢桿菌在改善腸道表型形態(tài)、維護腸道健康方面具有促進作用。

金子博（2018）和付天璽等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高魚體肝胰臟消化酶活性。本研究雖未測定各消化酶活性，但從肝臟、腎臟組織切片可看出，試驗組團頭魴肝臟、腎臟組織緊密性增強，分布均勻，腺體更加明顯，間接顯示出凝結(jié)芽孢桿菌能在一定程度上提高肝臟的消化代謝和排泄水平。

血液中白細胞數(shù)量與魚體的健康狀況息息相關(guān)，本研究中飼喂凝結(jié)芽孢桿菌后，團頭魴血液白細胞數(shù)量明顯上升，末期水平仍高出對照組，說明凝結(jié)芽孢桿菌對提高機體免疫力具有一定的作用。但試驗組血紅蛋白濃度和紅細胞數(shù)量指標變化明顯，這與張維娜等（2015）的研究結(jié)果類似，是否與凝結(jié)芽孢桿菌使用劑量有關(guān)還有待研究。血清總蛋白主要由血清球蛋白和血清白蛋白構(gòu)成，試驗組投喂后總蛋白含量稍有上升，白蛋白含量降低，表明凝結(jié)芽孢桿菌對血清球蛋白的生成具有促進作用。谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是衡量肝功能的重要指標。本研究中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性較投喂前降低，與張維娜等（2015）的0.3%凝結(jié)芽孢桿菌試驗組結(jié)果類似，進一步證實凝結(jié)芽孢桿菌對肝功能起到了一定的促進作用。尿素氮是動物體內(nèi)蛋白代謝的主要產(chǎn)物之一，投喂凝結(jié)芽孢桿菌后試驗組尿素氮含量降低，且低于對照組，說明凝結(jié)芽孢桿菌能提高團頭魴蛋白利用率，這與吳正可等（2021）的研究結(jié)果一致。堿性磷酸酶為生物體內(nèi)普遍存在并參與生命活動的一種代謝調(diào)控酶，本研究試驗組堿性磷酸酶活性略有降低，與張維娜等（2015）凝結(jié)芽孢桿菌試驗組結(jié)果類似，但與趙祖艷等（2021）的研究結(jié)果相反。這可能與飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌的劑量有關(guān)。

4 結(jié)論

日糧中添加107cfu/g凝結(jié)芽孢桿菌BC66可改善團頭魴腹腔充血狀況，可增強腸道韌性，提升肝、腎的組織形態(tài)，有助于消化代謝和排泄水平提升；可提高血液白細胞總數(shù)，促進免疫功能；可降低血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，有助于維持肝臟正常功能。