薛樹(shù)媛， 李九月， 田 豐， 王曉飛， 王 超， 英 蘭， 陳木蘭

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010031；2.興安盟畜牧工作站，內(nèi)蒙古烏蘭浩特137400）

反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)較為復(fù)雜的發(fā)酵容器，其內(nèi)寄居著種類(lèi)繁多、數(shù)量龐大的微生物菌群，主要有細(xì)菌、真菌和纖毛蟲(chóng)（秦建有，2020；解彪等，2018）。這些微生物起著調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境以及分解動(dòng)物機(jī)體中不能吸收的物質(zhì)，并產(chǎn)生一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要作用。這些微生物中，細(xì)菌占比較大，所以研究瘤胃細(xì)菌的組成對(duì)于瘤胃內(nèi)環(huán)境具有重要意義。優(yōu)化瘤胃微生物有助于幼畜的健康生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能，減少環(huán)境污染，并能提高畜產(chǎn)品品質(zhì)。哪些微生物在瘤胃中起著重要作用，以及改變飼料物理性狀是否有助于瘤胃微生物在瘤胃內(nèi)生長(zhǎng)定植是此次研究的目的。本試驗(yàn)借助于高通量測(cè)序，以及多種分析方法探究膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)瘤胃微生物的具體影響。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇3月齡、體重為（23±1.0）kg的杜寒雜交羔羊81只，隨機(jī)分為對(duì)照組（70%精料+30%干秸稈）、試驗(yàn)I組（70%精料+30%膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料）和試驗(yàn)II組（70%精料+30%膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料，再額外添加占日糧總蛋白濃度10%的膨化緩釋尿素NPN≥100%），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9只羔羊。試驗(yàn)期共75 d，其中預(yù)飼期15 d，正飼期60 d。正飼期結(jié)束后，從各組隨機(jī)挑選3只羊，空腹24 h后屠宰，采集瘤胃液，用4層紗布過(guò)濾，分裝于15 mL凍存管，置于液氮罐中保存，用于提取瘤胃微生物DNA。

1.2 試驗(yàn)日糧 本試驗(yàn)使用的精料是按美國(guó)NRC（2007）標(biāo)準(zhǔn)配制并委托興安盟九州大地飼料有限公司加工（表1）。粗飼料是由遼寧祥和農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司提供的膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料和粉碎玉米秸稈。膨化緩釋尿素（粗蛋白質(zhì)≥100%）由內(nèi)蒙古柯宏飼料有限公司提供。試驗(yàn)期日糧營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表1 精料組成與營(yíng)養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）

表2 試驗(yàn)期日糧營(yíng)養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 瘤胃液基因組DNA的提取 采用SDS法提取樣品基因組的DNA，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，在離心管中，用無(wú)菌水將樣品稀釋至1 ng/μL。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR模板使用稀釋后的樣本基因組DNA；根據(jù)測(cè)序區(qū)域設(shè)計(jì)帶Barcode的特異引物，其引物序列為：（341F 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'；806R5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）。使用New England Biolabs公司的PhusionRHigh-Fidelity PCR MasterMix with GC Buffer的30μL體系進(jìn)行PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表3。

表3 PCR反應(yīng)體系（30μL）

采用Bio-rad T100梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性1 min；30個(gè)循環(huán)包括（98℃10 s；50℃30 s；72℃30 s）；72℃5 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，經(jīng)過(guò)Qubit定量和檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的IonS5TMXL上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 利用Trimmomatic軟件將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，以序列末端的box序列校正序列方向，再按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到有效數(shù)據(jù)。舍棄低質(zhì)量序列（將read尾部質(zhì)量值處于20以下的堿基過(guò)濾掉，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的read）。質(zhì)控后的序列以16SrDNA序列97%的相似度進(jìn)行分類(lèi)劃分。獲得的OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)相似度為97%的OTUs進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在門(mén)、綱、目、科、屬的各個(gè)水平下，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。用version v.1.30.1指數(shù)分析軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，計(jì)算趙氏指數(shù)（Chao index）、艾斯指數(shù)（ACE index）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）及辛普森指數(shù)（Simpson index）。利用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差法分析不同處理組間的菌種豐度和Alpha指數(shù)，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)物種稀釋曲線的影響 如圖1所示，當(dāng)序列數(shù)目達(dá)到60000時(shí)，曲線趨向于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量漸進(jìn)合理。

圖1 物種稀釋曲線

2.2 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)Venn圖的影響如圖2所示，對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組共有OTUs條目1935條，對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組共有OTUs條目2223條，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組共有OTUs條目2273條，對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅱ組共有OTUs條目2155條，對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組獨(dú)有OTUs條目分別為203、270、498條，說(shuō)明試驗(yàn)Ⅱ組物種豐度要高于試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組。

圖2 Venn圖

2.3 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)物種相對(duì)豐度的影響

2.3.1 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)門(mén)級(jí)別物種相對(duì)豐度的影響 從圖3、表4可以看出，試驗(yàn)Ⅱ組變形菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)顯著低于其他兩組（P=0.04），試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組廣古菌門(mén)顯著高于對(duì)照組（P=0.03），試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組酸桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅱ組梭桿菌門(mén)顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于對(duì)照組（P=0.03）。試驗(yàn)Ⅰ組其他菌屬顯著高于其他兩組，對(duì)照組高于試驗(yàn)Ⅱ組（P=0.01）。兩試驗(yàn)組放線菌門(mén)趨于降低，但不顯著（P＞0.05）。其余厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和軟壁菌門(mén)組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖3 瘤胃微生物門(mén)級(jí)別物種相對(duì)豐度

2.3.2 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)屬級(jí)別物種相對(duì)豐度的影響 如圖4、表5所示，試驗(yàn)Ⅱ組未鑒別的-普雷沃氏菌屬顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于對(duì)照組（P=0.03）。試驗(yàn)Ⅰ組擬桿菌屬極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅱ組假單胞菌屬顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于對(duì)照組（P=0.03）。試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組未鑒別的-疣微菌屬顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組（P=0.04）。試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組的馬賽菌屬顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組（P=0.02）。兩試驗(yàn)組的昆內(nèi)拉菌屬顯著低于對(duì)照組（P=0.02）。試驗(yàn)Ⅱ組的甲烷短桿菌屬顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組（P=0.03）。未鑒別的-擬桿菌屬、帕拉擬桿菌屬、巨單胞菌屬和其他菌屬差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 瘤胃微生物屬級(jí)別物種相對(duì)豐度

表5 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)屬級(jí)別排名前十占比的影響%

2.4 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)Ternaryplot分析的影響 如圖5所示，3個(gè)試驗(yàn)組中的門(mén)級(jí)別優(yōu)勢(shì)物種分別為擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，且3個(gè)試驗(yàn)組豐度相近，可以說(shuō)明擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)是所有健康羊只瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌種。

圖5 三元相圖（門(mén)）

如圖6所示，三組中屬級(jí)別優(yōu)勢(shì)物種為未鑒別的-普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、未鑒別的-擬桿菌屬，不同組別豐度差異較大。

圖6 三元相圖（屬）

2.5 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)屬水平物種進(jìn)化樹(shù)的影響 如圖7所示，在屬水平物種進(jìn)化樹(shù)中，進(jìn)一步印證了三組中屬級(jí)別優(yōu)勢(shì)物種為未鑒別的-普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬、未鑒別的-擬桿菌屬，且在每組中的豐度差異較大。

圖7 瘤胃微生物屬水平物種進(jìn)化樹(shù)

2.6 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)門(mén)級(jí)別OTUs聚類(lèi)熱圖的影響 從圖8中可以看出，對(duì)照組的乳酸桿菌、廣古菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、迷蹤菌門(mén)、裝甲菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、纖細(xì)菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)、浮霉菌門(mén)這11個(gè)門(mén)高于其他兩組。試驗(yàn)Ⅰ組黏膠球形菌門(mén)、螺旋菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、儉菌總門(mén)、變形菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)、己科河菌門(mén)這8個(gè)門(mén)高于其他兩組。試驗(yàn)Ⅱ組軟壁菌門(mén)、放線細(xì)菌、食氫菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、黑水仙菌門(mén)、纖維桿菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、異常球菌-棲熱菌門(mén)、胼胝菌門(mén)、硝棘菌門(mén)、衣原體門(mén)、乙酰菌門(mén)、奇古菌門(mén)這14個(gè)門(mén)均高于其他兩組。由此可以看出，試驗(yàn)Ⅱ組豐度高于試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組的大多數(shù)為益生菌，而對(duì)照組則相反，豐度高于試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組的多數(shù)為致病菌。

圖8 OTUs熱圖（門(mén)級(jí)別）

2.7 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)等級(jí)聚類(lèi)曲線的影響 等級(jí)聚類(lèi)曲線可以直觀反映樣本中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，曲線的寬度反映了物種的豐富度，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線的平滑程度，表示樣本中物種的均勻程度，曲線越平緩，表示物種分布越均勻（Lundberg等，2013）。從圖9等級(jí)聚類(lèi)曲線中可以看出，試驗(yàn)Ⅱ組的物種豐富度高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，但三組的物種均勻度相似。

圖9 瘤胃微生物等級(jí)聚類(lèi)曲線

2.8 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)Alpha多樣性分析的影響 如表6所示，試驗(yàn)Ⅱ組的物種數(shù)目極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組的香農(nóng)指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P=0.04），試驗(yàn)Ⅰ組的趙氏指數(shù)極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組，且試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅱ組的艾斯指數(shù)極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），辛普森指數(shù)組間差異不顯著（P＞0.05）。

表6 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)Alpha Indices統(tǒng)計(jì)的影響

2.9 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)Beta多樣性分析的影響 圖10為基于Unweighted Unifrac Beta多樣性的箱形圖，由此箱型圖可以看出對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組存在的差異均較大，而試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組間差異則相對(duì)較小。

圖10 基于Unweighted Unifrac Beta多樣性的箱形圖

2.10 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)Anosim分析的影響 圖11為Anosim組間差異分析箱線圖，從圖中可知，試驗(yàn)Ⅱ組與其他兩組存在顯著差異，而對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組差異不顯著，因此證明分組有意義。

圖11 Anosim組間差異分析箱線圖

2.11 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)T檢驗(yàn)的影響從表7中可以看出，直至科分類(lèi)級(jí)別對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組才有組間差異物種。對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅱ組間物種差異從屬分類(lèi)級(jí)別上至門(mén)分類(lèi)級(jí)別，門(mén)分類(lèi)級(jí)別的T檢驗(yàn)依然顯示差異顯著。試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組在種分類(lèi)級(jí)別上桿菌_MC2010種為組間差異物種，當(dāng)分類(lèi)級(jí)別高于目時(shí)，則沒(méi)有組間差異物種，T檢驗(yàn)呈現(xiàn)不顯著。

表7 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)組間分類(lèi)水平差異物種的影響

2.12 膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料對(duì)功能注釋相對(duì)豐度的影響 如圖12所示，三組中各樣本在一級(jí)注釋層級(jí)上相對(duì)豐度較高的功能比例差異不大，并且T檢驗(yàn)呈不顯著。所以各組樣本中在一級(jí)注釋層級(jí)功能注釋差異不顯著。

圖12 功能注釋相對(duì)豐度

3 結(jié)果與討論

通過(guò)16s RNA的測(cè)序、分析，首先對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行篩選和拼接，得到需要的OTUs條目，再繪制稀釋曲線，當(dāng)序列條目達(dá)到60000時(shí)，曲線趨于平緩，說(shuō)明已經(jīng)注釋到了大部分，可以進(jìn)行后續(xù)分析。Venn圖顯示，試驗(yàn)Ⅱ組所獨(dú)有OTUs條目近似于其他兩組的二倍，試驗(yàn)Ⅱ組的物種豐富度比試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組更高，在后續(xù)的物種豐度柱狀圖、Ternaryplot分析、OTUs聚類(lèi)熱圖、等級(jí)聚類(lèi)曲線、Alpha分析中均顯示試驗(yàn)Ⅱ組具有更高的物種豐富度，且有益菌豐度更高。Beta分析則顯示，三組樣本在物種豐富度上組間差異性較大，進(jìn)一步證明試驗(yàn)Ⅱ組物種豐富度更高且有益菌豐度也比試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組高。Anosim（1999）分析證實(shí)了該分組方式有意義。T檢驗(yàn)顯示試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅰ組、對(duì)照組的差異物種豐度較高，印證了上述分析。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組使用膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料作為粗飼料，而膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料相比于其他粗飼料具有更多的空隙，有助于微生物的附著繁殖，進(jìn)而在瘤胃內(nèi)增加了有益菌的豐度。 也有可能是由于膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料的特殊物理結(jié)構(gòu)，使其更易于消化吸收，二者聯(lián)合作用，提高了羔羊生長(zhǎng)性能，但具體作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

韓旭峰（2015）認(rèn)為，不同日齡的陜北絨山羊瘤胃微生物組成成分是不同的，隨年齡增長(zhǎng)呈規(guī)律性變化，且瘤胃微生物也會(huì)因日糧中精料比例而發(fā)生變化。劉晶（2014）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)日糧中添加果膠時(shí)，果膠降解菌豐度會(huì)隨之升高，日糧的組成對(duì)瘤胃微生物的物種豐度具有影響力。BaoShan Xing等（2020）認(rèn)為，日糧中同時(shí)加入麥秸稈和高粱秸稈比單一加入一種秸稈時(shí)瘤胃內(nèi)特異性降解菌豐度要高。Shoukun等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，不同飼養(yǎng)方式下羔羊瘤胃微生物多樣性有明顯差異，舍飼條件下，瘤胃微生物多樣性更高，有利于減少CH4排放。前人對(duì)精粗比、添加劑和放牧方式對(duì)瘤胃微生物的影響均有所研究，但是關(guān)于粗飼料不同物理狀態(tài)對(duì)瘤胃微生物的影響則少有研究，所以本研究以粗飼料不同處理方式作為切入點(diǎn)，研究其對(duì)瘤胃微生物的影響。

直至科分類(lèi)級(jí)別對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組才有組間差異物種，可能是由于擬桿菌屬在物種豐度中占比較小，且擬桿菌屬的種分類(lèi)級(jí)物種分布較均勻，使得對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組在種分類(lèi)級(jí)別沒(méi)有特異性的差異物種。對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅱ組間物種差異從屬分類(lèi)級(jí)別上至門(mén)分類(lèi)級(jí)別，可能是由于甲烷短桿菌屬、毛螺菌屬在物種豐度中占比較大，致使門(mén)分類(lèi)級(jí)別的T檢驗(yàn)依然顯示差異顯著。試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組在種分類(lèi)級(jí)別上桿菌_MC2010種為組間差異物種，當(dāng)分類(lèi)級(jí)別高于目時(shí)，則沒(méi)有組間差異物種，T檢驗(yàn)呈現(xiàn)不顯著。

最終得出，試驗(yàn)Ⅱ組無(wú)論從物種豐度還是優(yōu)勢(shì)物種方面都優(yōu)于試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組，繼而證明膨化秸稈微生物發(fā)酵飼料提高蛋白水平后作為粗飼料有助于瘤胃微生物定植。

4 結(jié)論

玉米秸稈經(jīng)膨化和微生物發(fā)酵處理后對(duì)試驗(yàn)羔羊瘤胃微生物區(qū)系有著明顯的影響。改善了瘤胃微生物的豐富度，提高了瘤胃內(nèi)如擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、巨單胞菌屬和普雷沃氏菌科等有益菌種的數(shù)量，成為優(yōu)勢(shì)菌群。以纖維類(lèi)分解菌（普雷沃氏菌科）為代表的有益菌明顯增多，并且明顯降低了有害菌（假單胞菌）的種類(lèi)和數(shù)量。