辛 娜， 鄧露芳*， 郭 亮*， 黃玉海， 班文杰， 宗文麗， 劉憲輝

（1.北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京101105；2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京100076）

隨著全球范圍內(nèi)對抗生素的禁用，人們更加關(guān)注食品安全，追求綠色養(yǎng)殖。探尋綠色、安全、高效的抗生素替代品逐漸成為畜牧業(yè)的研究熱點。目前研究較多的有益生菌、植物提取物、酸化劑、酶制劑、抗菌肽等（卜孟娟等，2019；韓冰等，2017；盧國民等，2014；Cheng等，2014）。如何篩選并評價這些新型抗生素替代品顯得非常重要。本試驗旨在通過牛津杯擴散法篩選出具有體外抑菌效果的乳酸菌及飼料添加劑產(chǎn)品，為飼料替抗技術(shù)的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和飼料添加劑 乳酸菌菌株H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8為北京綠荷康牧生物科技有限公司實驗室篩選并保存。經(jīng)生理生化反應(yīng)及16s rRNA結(jié)合鑒定為嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、長雙歧桿菌、屎腸球菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌。苯甲酸、單寧酸、葡萄糖氧化酶、腸桿菌肽、溶菌酶，由北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司提供。

1.1.2 指示菌和培養(yǎng)基 大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、MRSbroth、MRSagar購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司

1.1.3 其他 滅菌鍋、潔凈工作臺、培養(yǎng)箱、烘箱、水浴鍋、牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm）、鑷子、一次性培養(yǎng)皿、無水乙醇、0.9%生理鹽水。

1.2 試驗方法 對致病菌的抑制試驗參照劉冬梅等（2006）牛津杯擴散法。取滅菌營養(yǎng)瓊脂，待溫度降至50℃左右時倒平板，每個平皿約15 mL。待瓊脂凝固后，用滅菌的鑷子夾牛津杯置于營養(yǎng)瓊脂平板中。每個平板放置4個牛津杯。分別取大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌0.1 mL（108cfu/mL）加入已經(jīng)滅菌100 mL營養(yǎng)瓊脂中（冷卻至50℃左右），搖勻后傾倒，注意不要起泡。待瓊脂凝固后，用鑷子將牛津杯夾出來，將孔進行標記，標記為1、2、3、4。孔1中加入200μL滅菌MRS液體培養(yǎng)基/配制飼料添加劑的溶劑（表1），取活化18 h的乳酸菌制劑/不同濃度的飼料添加劑200μL，加入2、3、4孔中，3個重復。置于4℃冰箱放置1 h后，置于37℃培養(yǎng)24 h。用游標卡尺量抑菌圈的大小。

表1 不同飼料添加劑的配制濃度 mg/L

2 結(jié)果與分析

2.1 單株乳酸菌菌液體外抑制作用試驗 從表2可以看出，H1、H3、H4、H8對大腸埃希氏菌有抑制作用，抑菌效果依次為H4＞H3＞H8＞H1。H1、H3、H4對鼠傷寒沙門氏菌有抑制作用，抑菌效果依次為H1＞H3＞H4。所有乳酸菌菌株對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。

表2 單株乳酸菌菌液體外抑制作用mm

2.2 復配乳酸菌菌液體外抑菌作用試驗 從表3可以看出，H1：H4：H5：H6=1:1:1:1復配后對大腸埃希氏菌有抑制作用，H2：H4：H6：H8=1:1:1:1復配后對鼠傷寒沙門氏菌有抑制作用。H1：H2：H3：H4：H5：H6：H7：H8=1:1:1:1:1:1:1:1復配后對鼠傷寒沙門氏菌有抑制作用。

表3 復配乳酸菌菌液體外抑菌作用 mm

2.3 單個飼料添加劑體外抑菌作用試驗 從表4可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，水解單寧酸的抑菌效果最好，對3株菌均有抑制作用（除濃度500 mg/L對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用外），且隨著單寧酸濃度的增加，抑菌圈越大，抑菌效果越好。葡萄糖氧化酶的抑菌效果次之，200、300 mg/L葡萄糖氧化酶對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌有抑制作用。苯甲酸、腸桿菌肽、溶菌酶對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌沒有抑制作用。

表4 單個飼料添加劑體外抑菌作用mm

2.4 復合飼料添加劑體外抑菌作用試驗 從表5可以看出，葡萄糖氧化酶200 mg/L+水解單寧酸500 mg/L+苯甲酸2000 mg/L及水解單寧酸500 mg/L+苯甲酸2000 mg/L對3種菌均有抑制作用。葡萄糖氧化酶200 mg/L+水解單寧酸500 mg/L對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌有抑制作用。葡萄糖氧化酶200 mg/L+苯甲酸2000 mg/L對3種菌均沒有抑制作用。

表5 復合飼料添加劑體外抑菌作用mm

3 討論

目前，常用的抗生素替代品有益生菌、植物提取物、酸化劑、酶制劑、抗菌肽等。這些飼料添加劑在調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系、抗腹瀉、增強機體的抵抗力和免疫力、提高動物生產(chǎn)性能及飼料轉(zhuǎn)化率等方面發(fā)揮了重要作用，而這些飼料添加劑的抑菌機理和抑菌效果不盡相同。

3.1 乳酸菌體外抑菌作用 乳酸菌及其代謝產(chǎn)物中富含乙酸、乳酸等有機酸，以及細菌素和過氧化氫等各種抑菌成分（Zhang等，2007；Servin，2004），能有效抑制有害菌。韓慶功等（2018）研究得出，植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物對豬源性大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的生長繁殖產(chǎn)生了抑制作用。郭奇苑等（2010）從15日齡健康犢牛的腸道黏膜和食糜中分離得到4株乳酸菌，對大腸桿菌抑制直徑可達16～21 mm。白天天等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，單菌液中，屎腸球菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果較好。組合菌液中，蒙氏腸球菌和鶉雞腸球菌組合對大腸桿菌的抑菌能力較強。于翠芳等（2019）從發(fā)酵食品中分離出7株乳酸菌，其中4株對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。本試驗結(jié)果表明，單菌液除H2、H5、H6、H7沒有抑菌作用，復合菌液除H3：H4：H6：H7=1:1:1:1沒有抑菌效果外，其他單菌液及復合菌液均有不同程度的抑菌效果。

3.2 飼料添加劑體外抑菌作用

3.2.1 飼料添加劑的抑菌機制 不同飼料添加劑抑菌機制不盡相同。苯甲酸作為酸化劑及防腐劑，可有效抑制多種微生物的生長和繁殖。主要是因為苯甲酸有較強的親脂性，易通過細胞膜進入細胞體內(nèi)，從而干擾微生物細胞膜的通透性，改變膜功能，引起菌體形態(tài)變化而死亡；另一方面，進入細胞內(nèi)的苯甲酸分子，可以電離酸化細胞內(nèi)的堿儲，并能抑制微生物細胞呼吸酶的活性，使微生物的代謝受障礙（唐茂妍等，2017）。單寧酸的多元酚羥基結(jié)構(gòu)使其具有良好的收斂抗腹瀉、抗氧化、抑菌和抗病毒等生理特性（Frasca等，2012）。單寧酸可能通過2條途徑發(fā)揮抑菌作用：一是單寧酸與細胞膜和細胞質(zhì)功能蛋白之間的直接相互作用，二是單寧酸對細菌細胞代謝（如代謝酶、脂質(zhì)和脂肪酸等）存在二次作用，可引起細菌細胞代謝功能改變（劉秀麗，2013；Bossi等，2007）。葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，具有去葡萄糖、脫氧、殺菌和產(chǎn)酸等特性，能催化β-D-葡萄糖脫氫氧化產(chǎn)生葡萄糖內(nèi)酯和過氧化氫，葡萄糖內(nèi)酯會轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸。葡萄糖酸呈酸性，可降低腸道的pH，抑制有害菌的生長。生成的過氧化氫具有廣譜殺菌作用，可直接抑制大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌的生長繁殖（王佰濤等，2019）。腸桿菌肽是由腸桿菌屬的細菌產(chǎn)生的一類小分子量的抗菌肽，腸桿菌肽可以通過膜穿孔作用以及抑制RNA轉(zhuǎn)錄酶的活性來針對性的殺滅致病性大腸桿菌以及沙門氏菌等革蘭氏陰性菌（Sable等，2000）。溶菌酶又稱細胞壁溶解酶，是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶類，能使微生物細胞壁中黏多糖成分分解，降低細菌細胞壁的穩(wěn)定性，細菌細胞壁會因內(nèi)、外滲透壓不平衡而破裂、細胞質(zhì)外泄，最終死亡。因革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁結(jié)構(gòu)不同，導致溶菌酶對革蘭氏陽性菌的抑菌效果顯著好于革蘭氏陰性菌（劉益麗等，2013）。溶菌酶對革蘭氏陰性菌也有較強的作用（李義等，2012；楊向科等，2005）。

3.2.2 影響飼料添加劑抑菌作用的因素

3.2.2.1 抑菌試驗條件的影響 高增兵等（2014）試驗揭示，在pH為5.0、5.5時，高濃度的苯甲酸抑菌能力更明顯。當pH達到6.0以上時，所有苯甲酸濃度間的抑菌能力趨于一致。湯海鷗等（2015）研究不同處理溫度下葡萄糖氧化酶混合液的抑菌效果。結(jié)果表明，與常溫對照組（25℃）相比，65℃未出現(xiàn)顯著差異，高于65℃抑菌效果逐步降低，且65℃與75℃之間有顯著性差異。苯甲酸鈉對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑制程度隨其濃度增加逐漸增強，濃度為0.3%時，抑菌作用驟然加強，當濃度為1.0%時，兩種菌生長幾乎完全受到抑制（胡春紅等，2011）。鄭正男等（2015）試驗表明，單寧酸在酸性條件下比堿性條件下的抑菌效果更好，呈現(xiàn)出由酸到堿菌落密度增大的趨勢，pH為3～7時，顯示出良好的抑菌效果，pH為8時，只對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有較好的抑菌效果。

3.2.2.2 抑菌試驗方法的影響 潘曉倩等（2014）用5種不同檢測方法評價抗菌肽體外抑菌效果，定性抑菌結(jié)果揭示，3種瓊脂擴散的靈敏度不一致，打孔法的靈敏度最高，其次是濾紙片法，最后是牛津杯法。定量抑菌試驗揭示，活菌計數(shù)法比酶標比濁法的靈敏度更高。劉如運（2013）結(jié)果表明，試管二倍梯度稀釋法更為直觀、可靠，可進行定量抑菌分析。瓊脂擴散法抑菌試驗中牛津杯法最好，其次是平板打孔法，進行火焰封底效果更好，濾紙片法結(jié)果一般。

3.2.2.3 標準指示菌株的影響 張江等（2018）研究腸桿菌肽對大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌效果，結(jié)果表明，0.5%腸桿菌肽對不同種屬來源的大腸桿菌、沙門氏菌的最小抑菌濃度（MIC）不盡相同。熊海濤等（2019）得出，相同濃度的腸桿菌肽對不同來源的大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌程度不同。

3.2.2.4 飼料添加劑來源的影響 ELizondo等（2010）對不同來源的單寧酸（白堅木、栗木或二者的組合）進行體外試驗，研究其對健康動物和患病動物腸道中A、B、C、D、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栗木單寧酸的抑菌活性優(yōu)于白堅木單寧酸。

3.2.2.5 其他因素 飼料添加劑中部分添加劑有載體混合處理，載體會干擾試驗結(jié)果。植物精油類產(chǎn)品會進行包被處理，包被物往往也會影響試驗結(jié)果。此外，平板的厚度不同也會影響添加劑在平板中的擴散。

本試驗結(jié)果顯示，單寧酸和葡萄糖氧化酶均表現(xiàn)出一定的抑菌作用，而苯甲酸、腸桿菌肽、溶菌酶沒有表現(xiàn)出抑菌作用。苯甲酸由于微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有機溶劑，在用瓊脂擴散法評價其抑菌效果時，會出現(xiàn)有機溶劑的揮發(fā)，導致結(jié)果的不準確。腸桿菌肽和溶菌酶沒表現(xiàn)出抑菌作用可能與測試濃度的選擇、抑菌試驗條件（如酸度、溫度）、方法的選擇、測試菌株不同種屬等均有一定關(guān)系。復合飼料添加劑試驗中，添加單寧酸的復合飼料添加劑均表現(xiàn)出較好的抑菌效果，再次印證水解單寧酸的抑菌效果最好。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，乳酸菌、單寧酸、葡萄糖氧化酶均具有較好的體外抑菌效果。