熊海風(fēng) 劉若雅 李任城 楊 博 黎啟航 占華松 楊 淵

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530001，電子郵箱：496095683@qq.com；2 廣西醫(yī)大開元埌東醫(yī)院骨科，廣西南寧 530021)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以對稱性關(guān)節(jié)炎癥為特征，導(dǎo)致軟骨破壞、骨侵蝕甚至殘疾的慢性自身免疫性疾病[1]。目前，本病的確切病因以及病理機(jī)制仍未明確，研究表明多種遺傳因素和環(huán)境因素作用于關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、關(guān)節(jié)囊等部位，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性反應(yīng)，從而引起RA及其一系列并發(fā)癥的發(fā)生[2]。RA的主要臨床癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能受限，此外，還可出現(xiàn)明顯的晨僵和類似增生性關(guān)節(jié)病的關(guān)節(jié)僵硬現(xiàn)象。西醫(yī)中，RA的總治療目標(biāo)是完全緩解(至少顯著降低疾病活動性)時間控制在6個月以內(nèi)，以預(yù)防關(guān)節(jié)損傷、殘疾和全身表現(xiàn)[3]。為達(dá)到此目的，一般選擇糖皮質(zhì)激素、改善病情抗風(fēng)濕藥物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、生物制劑等藥物治療[4-7]。但這些藥物各有缺點(diǎn)：糖皮質(zhì)激素療效最差，且副作用眾多[8]；DMARDs所引起的不良反應(yīng)大[5]；NSAIDs則只能減輕疼痛和腫脹并改善關(guān)節(jié)功能，但不能防止額外的關(guān)節(jié)損傷，對疾病無治愈效果[6];生物制劑[7]價格昂貴，且副作用較多。因此，急需尋求新的方法治療RA。

祖國中醫(yī)藥傳承歷史悠久，對于臨床上多種疑難雜癥的治療頗有療效，且具有治療費(fèi)用低和毒副作用較小等優(yōu)點(diǎn)，故利用中醫(yī)藥辨證論治RA是一條可探尋之路[9]。根據(jù)RA的致病特點(diǎn)，祖國中醫(yī)藥將其歸類為“尪痹”范疇[10]，其中“尪”始出于張仲景所著《金匱要略》“中風(fēng)歷節(jié)病篇”中所言的歷節(jié)病，“諸肢節(jié)疼痛，身體尪羸”?！掇o源》為其注曰： “骨骼彎曲癥，脛、背、胸彎曲都叫尪?！薄氨浴奔幢圆?。因此，“尪痹”指具有關(guān)節(jié)疼痛、變形、僵硬、屈伸不利以及肌肉萎縮等癥狀的痹病。根據(jù)不同病因病機(jī)及臨床癥狀，RA可以分為腎虛寒侵、寒濕痹阻、痰瘀痹阻、瘀血阻絡(luò)等不同證型。根據(jù)不同證型，遣方用藥也不盡相同，其中真武湯亦是治療尪痹的經(jīng)典方劑之一。真武湯見于張仲景所著《傷寒雜病論》，具有溫陽利水之功效，故可治療RA中屬腎虛寒侵之證者。然而，真武湯治療RA的作用機(jī)制尚不明確。故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對真武湯治療RA的主要成分、靶點(diǎn)、通路進(jìn)行分析，進(jìn)而預(yù)測真武湯治療RA的藥理作用機(jī)制，旨在為臨床治療RA提供新的思路與方向。

1 資料與方法

1.1 真武湯有效化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(https://tcmspw.com/news.php)對真武湯中的茯苓、白芍、生姜、附子、白術(shù)5種中藥進(jìn)行檢索，以藥物口服利用度≥30%、類 藥 性≥0.18作為篩選條件，篩選出5種中藥的化學(xué)成分。將得到的化學(xué)成分通過DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，刪除無法預(yù)測到作用靶點(diǎn)的化學(xué)成分，保留有效化學(xué)成分及其靶點(diǎn)。在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://sparql.uniprot.org/)中，設(shè)定“Human”及“Reviewed”為篩選條件，獲取靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名稱文件，最后通過Perl軟件(https://www.perl.org/)將預(yù)測靶點(diǎn)與基因名稱建立聯(lián)系。

1.2 真武湯有效化學(xué)成分-藥物靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為方便作圖，將篩選出的有效化學(xué)成分以拼音首字母和數(shù)字為組合進(jìn)行編號，將篩選得到的有效化學(xué)成分編號與藥物靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/)中，構(gòu)建出有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)；然后使用網(wǎng)絡(luò)中Network Analyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，通過設(shè)置節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)大小與節(jié)點(diǎn)圖形大小呈正相關(guān)來體現(xiàn)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度(而圖形中Degree越大，則節(jié)點(diǎn)圖形越大)。

1.3 RA相關(guān)疾病靶點(diǎn)的預(yù)測 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索“Rheumatoid Arthritis”，收集與RA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因，通過Relevance score值大小(中位數(shù)以上)作為篩選條件，去除冗雜，篩選出相關(guān)度更高的靶點(diǎn)基因。

1.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的確定及蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過R語言4.0.0版(https://www.r-project.org/)將真武湯藥物靶點(diǎn)基因與RA疾病靶點(diǎn)基因取交集，并構(gòu)建Venn圖，其中交集的靶點(diǎn)基因可能是真武湯中藥物治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件，構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，并以網(wǎng)絡(luò)度(degree)值>61、介數(shù)(betweenness)值>2100作為篩選條件，得到核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5 功能富集分析與通路富集分析 運(yùn)用R語言及DAVID數(shù)據(jù)平臺(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(設(shè)定P<0.05，Q<0.05)，進(jìn)一步分析真武湯治療RA的潛在作用機(jī)制。

1.6 構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，然后使用Network Analyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，從而使關(guān)系網(wǎng)絡(luò)更數(shù)據(jù)化，并通過設(shè)置節(jié)點(diǎn)的Degree值大小與節(jié)點(diǎn)圖形大小成正相關(guān)來體現(xiàn)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

2 結(jié) 果

2.1 真武湯的有效化學(xué)成分及其對應(yīng)靶點(diǎn) 針對真武湯5味中藥，共檢索出61個化學(xué)成分，其中茯苓15個、白芍13個、生姜5個、附子21個、白術(shù)7個。其中有36個化學(xué)成分未找到相關(guān)作用靶點(diǎn)，故去除。最終獲得23個有效化學(xué)成分(茯苓6個、白芍8個、生姜1個、附子6個、白術(shù)4個，其中附子/白芍、生姜/白芍各重疊1個)，見表1。23個有效化學(xué)成分對應(yīng)244個相關(guān)靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫和Perl軟件，找到靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名稱并建立聯(lián)系，去除重復(fù)項(xiàng)后共獲得對應(yīng)靶點(diǎn)基因85個。

2.2 真武湯有效化學(xué)成分-藥物靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)圖 將有效化學(xué)成分進(jìn)行編號后，利用Cytoscape軟件構(gòu)建有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)共包括115個節(jié)點(diǎn)和297個相互關(guān)系，根據(jù)Degree值，排名前5位的化合物分別是β-谷甾醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)、木犀草素(MOL000296)、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮(MOL000049)、石防風(fēng)素(MOL002392)，見表1。

表1 真武湯有效成分信息

圖1 真武湯有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)

2.3 RA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因及交集靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò) 共獲得RA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因1089個。將1089個疾病靶點(diǎn)基因與真武湯有效化學(xué)成分的靶點(diǎn)基因通過R語言繪制Venn圖(見圖2),獲得43個交集靶點(diǎn)基因，可能是真武湯治療 RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。將交集靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)，然后篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，見圖3。其中Degree值排名較前的靶點(diǎn)基因?yàn)闊嵝菘说鞍?heat shock protein,HSP)90AA1、雌激素受體1、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)、雄性激素受體、轉(zhuǎn)錄因子P65等。

圖2 Venn圖

圖3 交集靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心網(wǎng)絡(luò)

2.4 交集靶點(diǎn)基因的GO富集分析 運(yùn)用R語言及DAVID數(shù)據(jù)平臺對獲得的交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)每條項(xiàng)目的P值及基因數(shù)的不同，以P值及關(guān)聯(lián)基因數(shù)升序排列，對其進(jìn)行可視化處理，獲得GO分析氣泡圖，見圖4。結(jié)果顯示，在生物過程中確定有841個GO條目，主要富集在對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)等生物過程中。

圖4 交集靶點(diǎn)基因的GO分析氣泡圖

2.5 交集靶點(diǎn)基因的KEGG通路富集分析 運(yùn)用R語言及DAVID數(shù)據(jù)平臺對獲得的交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)每條通路上富集基因數(shù)目及顯著性的不同，以基因數(shù)目及顯著性升序排列，對其進(jìn)行可視化處理，獲得KEGG富集分析氣泡圖。顯著性表現(xiàn)為：P值越小，顯著性越高(顏色越紅)；關(guān)聯(lián)基因數(shù)與GO上總基因數(shù)的比值越大，顯著性越高(x軸值越大)。見圖5。結(jié)果共獲得107條通路，主要富集在流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、在糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)-AGE受體(receptor of AGE,RAGE)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17等信號通路，而圖5顯示的其他重要信號通路，無大量文獻(xiàn)支持其與RA的相關(guān)性。所建立的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中共有45個節(jié)點(diǎn)、203個相互關(guān)系(見圖6)，從圖中可看出，1條 KEGG通路往往可以富集到多個靶點(diǎn)基因，而1個靶點(diǎn)基因同時又可以出現(xiàn)在多條通路中。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

圖6 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

真武湯由茯苓、白芍、生姜、附子、白術(shù)5味中藥組成，是溫陽利水的經(jīng)典方劑[11]，可有效治療腎虛寒侵之證的RA?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老的作用[12]，白術(shù)具有抗腫瘤、抗炎的作用[13]，白芍具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎的作用[14]，附子具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[15]，生姜具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[16]。盡管現(xiàn)代藥理學(xué)對真武湯中的5味中藥已經(jīng)有了較為深入的研究，但是其治療RA的具體作用機(jī)制鮮有研究報告。

本研究結(jié)果顯示，真武湯的有效化學(xué)成分中，節(jié)點(diǎn)的Degree值位列前5的為β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、石防風(fēng)素。其中，β-谷甾醇可以減少血管內(nèi)的一氧化氮，并促進(jìn)細(xì)胞鈣的攝取，以此抑制巨噬細(xì)胞生成IL-6、髓過氧化物酶、腺苷脫氨酶，從而抑制IL-1β、TNF-α等炎性因子的分泌，最終發(fā)揮抗炎效果[17-18]。山柰酚可通過增加S期細(xì)胞數(shù)量以改變細(xì)胞的周期，從而介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)、疾病預(yù)防方面的作用；同時，其可以通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，以及降低抗酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K的活力，抑制骨吸收，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用；此外，山奈酚還有抗炎、抗氧化、降血糖、對損傷組織的保護(hù)等作用[19-20]。木犀草素具有體內(nèi)外同時抗炎的作用[21]，其抗炎作用是通過多個途徑來發(fā)揮的，主要包括抑制活性氧及一氧化氮的生成[22]，調(diào)節(jié)IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、干擾素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-10等炎性因子及炎性介質(zhì)水平[23]，影響核因子κB、 激活蛋白1、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等信號通路[24-26]。而3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮及石防風(fēng)素的作用則少有相關(guān)研究報告。因此，β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等成分可能在真武湯治療RA的過程中發(fā)揮較為重要的作用。

在對藥物靶點(diǎn)基因及疾病靶點(diǎn)基因的交集基因進(jìn)行PPI分析后，發(fā)現(xiàn)其中Degree值排名較前的靶點(diǎn)基因?yàn)镠SP90AA1、雌激素受體1、VCAM1、雄性激素受體、轉(zhuǎn)錄因子P65等。HSP90AA1可編碼合成HSP90α，而HSP90α作為HSP90的亞型，除了在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用外，還在傷口愈合和炎癥中發(fā)揮分泌細(xì)胞外因子的作用。細(xì)胞外的HSP90α通過激活核因子κB和STAT3轉(zhuǎn)錄程序(包括促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-8)，從而起到誘導(dǎo)炎癥的作用[27]。VCAM1可增加白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性，并為其遷入內(nèi)皮下參與病理過程創(chuàng)造條件[28]。性激素在免疫反應(yīng)及局部炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，其中雌激素可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增加、協(xié)同促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增加，以此加強(qiáng)免疫能力[29]；并且可通過降低如IL-1β、IL-6等炎性介質(zhì)水平，達(dá)到抑制炎癥的作用[30]。轉(zhuǎn)錄因子P65是核因子κB的亞基之一，其與P50共同組成核因子κB，而核因子κB是在RA患者中高表達(dá)的活化因子[31]，參與RA病程中的滑膜細(xì)胞增殖凋亡、炎性細(xì)胞因子的啟動、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[32-34]。由此可見，真武湯可能是通過調(diào)節(jié)HSP90AA1、雌激素受體1、VCAM1、雄激素受體1、轉(zhuǎn)錄因子P65等靶點(diǎn)基因來達(dá)到治療RA的效果。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，交集靶點(diǎn)基因主要富集在流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。RA的炎癥反應(yīng)會使IL-6、IL-1、TNF-α等促炎癥細(xì)胞因子釋放進(jìn)血液循環(huán)系統(tǒng)中，再進(jìn)入內(nèi)皮組織中，從而引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致動脈粥樣硬化等一系列心血管疾病[35]。流體剪切應(yīng)力是內(nèi)皮細(xì)胞接受的最主要力學(xué)刺激，通過改善流體剪切應(yīng)力可保護(hù)內(nèi)皮組織，從而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附并改善動脈粥樣硬化[36]；同時，流體剪切應(yīng)力可通過激活Wnt信號通路、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5信號通路等來達(dá)到促進(jìn)骨細(xì)胞增殖分化及抑制骨細(xì)胞凋亡的作用[37-38]。而AGE與RAGE的相互作用是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的最主要原因之一[39]。其中RAGE是細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族的成員之一，其作為促炎性介質(zhì)在炎癥反應(yīng)中起作用，AGE與RAGE相互作用后，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶或核因子κB來上調(diào)IL-1β和TNF-α等炎性介質(zhì)水平，從而引起炎癥反應(yīng)[39-40]。TNF信號通路和IL-17信號通路與RA的炎癥反應(yīng)有密切聯(lián)系[41]，且已有大量研究證明，本文不再贅述。此外，GO富集分析結(jié)果顯示，真武湯治療RA主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)等生物過程。現(xiàn)有研究顯示，脂多糖是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，其可作為生物效應(yīng)器刺激宿主對細(xì)菌感染發(fā)生反應(yīng)，免疫刺激作用較強(qiáng)；脂多糖可與位于細(xì)胞表面的Toll樣受體4結(jié)合，當(dāng)Toll樣受體4識別脂多糖后，會刺激受體相關(guān)激酶及核因子κB，后者會上調(diào)炎性介質(zhì)水平，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[42]。且有學(xué)者指出，RA患者對脂多糖的刺激敏感性增加，認(rèn)為脂多糖可能在誘發(fā)RA發(fā)生的過程中起到重要作用[43]。由此推測，真武湯可能是通過改變流體剪切應(yīng)力以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫能力來發(fā)揮治療RA的作用。

綜上所述，真武湯可能是通過調(diào)節(jié)HSP90AA1、雌激素受體1、VCAM1、雄激素受體、轉(zhuǎn)錄因子P65等靶點(diǎn)基因，調(diào)控糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等通路，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫能力來治療RA。這體現(xiàn)真武湯多成分、多靶點(diǎn)、多途徑相互協(xié)同發(fā)揮作用的特點(diǎn)。但是受限于各平臺數(shù)據(jù)庫及軟件功能，本研究仍有很多不足之處，故得到的結(jié)果還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的驗(yàn)證。