蔣月麗 解龍昌 何超明 龐明武 梁 冬

(1 海南省三亞中心醫(yī)院/海南省第三人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，三亞市 572000，電子郵箱：jiangyueli8294@163.com； 2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東省廣州市 510260；3 三亞中心醫(yī)院/海南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南省三亞市 572000)

癲癇是一種慢性腦部疾病，發(fā)作時(shí)常伴有認(rèn)知、精神、社會(huì)學(xué)等諸方面功能障礙，反復(fù)性、短暫性是其發(fā)病的主要特征[1]。據(jù)調(diào)查，我國癲癇發(fā)病率為4.4%～4.8%，患病對(duì)患者心理發(fā)育和生活質(zhì)量產(chǎn)生的影響較大[2]。目前主要以臨床資料和發(fā)作期的腦電圖表現(xiàn)作為癲癇的診斷依據(jù)[3]，但早期癲癇病情的評(píng)估診斷需要有完整的臨床資料、準(zhǔn)確且及時(shí)的腦電圖結(jié)果，這使得癲癇診斷的時(shí)效性有所下降。因此，尋找一種評(píng)估癲癇病情的新指標(biāo)對(duì)診斷癲癇有重要意義。P53基因是一種腫瘤抑制基因，對(duì)細(xì)胞分裂、增殖起負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)可作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞生長期發(fā)揮調(diào)控作用[4]。P53基因還參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茲海默病、亨廷頓病等細(xì)胞凋亡過程[5]。微小RNA-34a(microRNA-34a，miRNA-34a)普遍存在于真核微生物中，是重要的炎癥應(yīng)答調(diào)控基因[6]，且與多種組織、器官、惡性腫瘤的增殖、分化和凋亡有關(guān)[7]，還與腦損傷有密切聯(lián)系[8]。但關(guān)于P53、miRNA-34a在癲癇患者中表達(dá)情況的研究較少。本研究檢測(cè)癲癇患者腦脊液和血清中P53、miRNA-34a 的表達(dá)水平，探討二者在癲癇診斷中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年2月至2020年3月于三亞中心醫(yī)院住院治療的79例癲癇患者作為癲癇組，選取同期以頭痛癥狀為主，但神經(jīng)系統(tǒng)體征、腦脊液及相關(guān)輔助檢查均正常的73例患者作為對(duì)照組。癲癇組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合癲癇診療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)病歷資料齊全者；(3)有頭顱CT或MRI等神經(jīng)影像學(xué)和腦電圖檢查結(jié)果者；(4)可明確觀察到治療效果且病程在6個(gè)月以上者；(5)年齡≥18歲者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)僅有一次臨床發(fā)作者；(2)因低血糖或肝、腎等臟器病變引起抽搐的患者；(3)因腦出血、腦腫瘤等引起抽搐的患者；(4)腦電圖有癇性放電但臨床發(fā)作不典型者。對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)頭顱CT、MRI等神經(jīng)影像學(xué)和腦電圖檢查結(jié)果無異常；(3)無低血糖或肝腎等臟器病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)依從性較差，無法配合完成指標(biāo)檢測(cè)；(2)因個(gè)人原因中途退出實(shí)驗(yàn)。癲癇組年齡18～54(35.94±8.14)歲，男性41例，女性38例；對(duì)照組年齡18～53(36.73±7.35)歲，男性34例，女性39例。兩組研究對(duì)象的年齡、性別、文化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究所有研究對(duì)象均由兩名主治及以上職稱的醫(yī)師明確診斷，研究經(jīng)三亞中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)；所有受試對(duì)象均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究內(nèi)容后自愿參加，均簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料的比較

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集：收集兩組患者入院前的一般資料，包括性別、年齡、文化程度(低：小學(xué)及以下；中：初高中；高：大學(xué)及以上)

1.2.2 標(biāo)本采集：(1)腦脊液，所有研究對(duì)象于治療前接受常規(guī)腰椎穿刺取新鮮腦脊液3 mL，室溫1 500 r/min離心10 min，取上層清液，置于-80℃保存待測(cè)。(2)血清，所有研究對(duì)象于治療前抽取清晨空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80℃保存待測(cè)。

1.2.3 腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a表達(dá)水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)兩組腦脊液和血清P53mRNA、miRNA-34a的表達(dá)水平。采用RNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司，貨號(hào)：dp419)分別提取腦脊液和血清總RNA，測(cè)定RNA的純度及濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號(hào)：KL266)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用CFX384型實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)對(duì)P53、miRNA-34a進(jìn)行擴(kuò)增(qPCR Kit試劑盒購自德國QIAGEN公司，貨號(hào)：218076)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系共10μL：cDNA(50 ng/μL)1μL，miScript SYBR? Green Mix 5 μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，ddH2O 3.0 μL。引物由上海生工生物公司合成，序列見表2。P53 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃、15 s，60℃、1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。miRNA-34a 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95℃， 5 min； 95℃、 15 s，58℃、 20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。采用2-ΔΔCt法對(duì)腦脊液和血清P53mRNA、miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.3 認(rèn)知功能評(píng)估：采用神經(jīng)心理學(xué)量表對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估[10]，包括蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)定向力、MoCA命名、MoCA延遲回憶、連線測(cè)驗(yàn)A(Trail Making Test A，TMT A)耗時(shí)、連線測(cè)驗(yàn)B(Trail Making Test B，TMT B)耗時(shí)、阿爾茨海默病評(píng)估量表認(rèn)知部分(Alzheimer′s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale，ADAS-Cog)單詞回憶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法分析癲癇患者腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a水平與認(rèn)知功能的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平的比較 癲癇組腦脊液P53 mRNA、miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平及血清P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 兩組認(rèn)知功能的比較 兩組MoCA命名得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，癲癇組TMT A耗時(shí)、TMT B耗時(shí)、ADAS-Cog單詞回憶得分高于對(duì)照組，MoCA定向力、MoCA延遲回憶得分低于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組認(rèn)知功能比較(x±s)

2.3 癲癇患者腦脊液和血清P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與miRNA-34a 相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，癲癇患者腦脊液P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與腦脊液miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.681，P<0.001)，血清P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.500，P<0.001)。

2.4 癲癇患者腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平與認(rèn)知功能的相關(guān)性 癲癇患者M(jìn)oCA定向力得分、MoCA延遲回憶得分與腦脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；癲癇患者TMT A耗時(shí)、 TMT B耗時(shí)、ADAS-Cog單詞回憶得分與腦脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 癲癇患者腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平與認(rèn)知功能的相關(guān)性

3 討 論

癲癇是諸多因素引起大腦神經(jīng)元異常放電所致的短暫性腦功能失調(diào)病，是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，發(fā)病率和病死率較高[11]，通?？梢鸹颊哒J(rèn)知功能損害[12]，給患者及其家庭帶來沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)對(duì)社會(huì)產(chǎn)生較多負(fù)面影響[13]。癲癇早期診斷主要依靠臨床資料和腦電圖表現(xiàn)，但這些在臨床上的應(yīng)用有限。尋找新的標(biāo)志物對(duì)癲癇進(jìn)行早期診斷，有益于尋找合理有效的防治措施，降低癲癇的發(fā)病率和死亡率。

P53是基因編碼的一種參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白，在神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要作用[14]。P53基因作為抑癌基因可以對(duì)細(xì)胞的生長和分化進(jìn)行調(diào)控，且能在一定程度上反映神經(jīng)元損害程度，從而反應(yīng)癲癇患者的病情[15]。研究表明，丹酚酸B誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作幾小時(shí)后，P53 mRNA在神經(jīng)元中的表達(dá)水平增加，且相關(guān)區(qū)域有神經(jīng)元損害[16]。miRNA-34a普遍存在于脊椎動(dòng)物腦組織內(nèi)，能通過抑制炎癥因子的分泌來緩解炎癥反應(yīng)，同時(shí)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)干細(xì)胞的生長發(fā)育[17]。miRNA-34a在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，具有腫瘤抑制作用[18]。研究表明，顱腦損傷患者腦部神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中miRNA-34a的表達(dá)水平下降[19]。李蘭[20]檢測(cè)癲癇患者腦脊液及血清中各種miRNA的水平并分析其對(duì)相關(guān)炎性因子的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)miRNA-34a水平在腦脊液中表達(dá)上調(diào)而在血清中表達(dá)下調(diào)，提示miRNA-34a能調(diào)節(jié)炎性因子并參與神經(jīng)元功能的改變。本研究結(jié)果顯示，癲癇組腦脊液中P53 mRNA、miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，血清P53 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，但血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。這提示，在癲癇發(fā)病過程中，癲癇患者腦脊液中miRNA-34a的表達(dá)水平上升，血清中miRNA-34a表達(dá)水平下降，分析原因可能是miRNA-34a從血清中移位進(jìn)入腦脊液，從而調(diào)節(jié)腦脊液中炎性因子的表達(dá)，進(jìn)一步影響癲癇的發(fā)病過程。而P53無論是在血清還是在腦脊液中都影響神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，參與癲癇的發(fā)生、發(fā)展，因此，癲癇發(fā)作時(shí)腦脊液和血清的P53 mRNA表達(dá)水平上調(diào)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，癲癇患者腦脊液P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與腦脊液miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)，血清P53 mRNA表達(dá)水平與血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。這進(jìn)一步提示機(jī)體通過下調(diào)血清中miRNA-34a的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)腦組織中炎性因子水平，上調(diào)腦脊液和血清中的P53 mRNA表達(dá)水平來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的凋亡情況，兩者通過各自的生理機(jī)制共同參與癲癇病的發(fā)生、發(fā)展。

認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與癲癇患者大腦結(jié)構(gòu)損害有密切聯(lián)系，能進(jìn)一步影響癲癇患者的病情[21]。本研究結(jié)果顯示，認(rèn)知功能評(píng)定中癲癇組TMT A耗時(shí)、TMT B耗時(shí)、ADAS-Cog單詞回憶得分高于對(duì)照組，MoCA定向力、MoCA延遲回憶得分低于對(duì)照組；癲癇患者M(jìn)oCA定向力、MoCA延遲回憶得分與腦脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清中P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)；癲癇患者TMT A耗時(shí)、 TMT B耗時(shí)、ADAS-Cog單詞回憶得分與腦脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清P53 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)，與血清miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。這提示腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相對(duì)表達(dá)水平與認(rèn)知功能障礙有關(guān)，進(jìn)一步證明二者與癲癇病情的發(fā)展有密切聯(lián)系，檢測(cè)腦脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a水平或可作為癲癇診斷或治療評(píng)估的一種方法。

綜上所述，P53 mRNA在癲癇患者腦脊液和血清中均呈高表達(dá)，miRNA-34a在腦脊液中呈高表達(dá)，在血清中呈低表達(dá)。認(rèn)知功能與腦脊液及血清P53 mRNA、miRNA-34a水平均相關(guān)。但P53 mRNA、miRNA-34a水平影響癲癇患者病情的具體機(jī)制仍未十分明確，且本研究樣本數(shù)量較小，相關(guān)結(jié)果還有待進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。