趙艷利，康志強，毛 雨，張曉珂，孫 玲，汪 湲

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450000)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，研究表明，10%～15%的PTC患者是中度分化的PTC變異型，這種變異型可促進癌細胞的侵略性，導致患者具有較高病死率[1-2]。微RNA(microRNA，miRNA)是非編碼的小分子RNA，與特定靶基因3′非翻譯區(qū)結合后共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[3-4]。研究表明，miR-152在PTC中表達下調(diào)，在PTC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]，但miR-152在PTC中的具體作用機制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)PTC細胞株TPC-1，觀察miR-152異常表達對TPC-1細胞生物學功能的影響，并預測miR-152可能作用的靶基因，為尋找PTC新的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器人PTC細胞株TPC-1、正常甲狀腺細胞株Nthy-ori 3-1由上海中國科學院細胞研究所提供；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自美國Gibco公司，兔多克隆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)Raft關聯(lián)蛋白1(endoplasmic reticulum lipid raft associated protein 1，ERLIN1)抗體購自英國Abcam公司，miR-152 mimics、miRNA-mimics陰性對照購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative reverse transcription polymerasechain reaction，qRT-PCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Mir-162-PC/Mir-262-PC型CO2培養(yǎng)箱購自日本松下公司，SpectraMax?iD5酶標儀購自美國Molecular Devices公司，BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司，XDS-10顯微鏡購自上海炳宇光學儀器有限公司，ChemiDocXRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將TPC-1、Nthy-ori 3-1細胞接種于DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，細胞融合達80%左右時進行消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞處理及分組取對數(shù)生長期TPC-1細胞，以每孔2×105個細胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，當細胞融合達80%時進行轉(zhuǎn)染，將TPC-1細胞隨機分為miR-152組(轉(zhuǎn)染miR-152-mimics至TPC-1細胞內(nèi))、miR-con組(轉(zhuǎn)染miRNA-mimics陰性對照至TPC-1細胞內(nèi))及空白對照組(不做任何處理)；另取對數(shù)生長期Nthy-ori 3-1細胞作為Nthy-ori 3-1組。

1.2.3 qRT-PCR法檢測各組細胞中miR-152、ERLIN1 mRNA表達提取各組細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，配制20 μL反應體系，于qRT-PCR儀上進行擴增。反應條件：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)。miR-152上游引物序列為5′-GCCCAGGTTCTGTGATACACT-3′，下游引物序列為5′-CCCAAGTTCTGTCATGCAC-3′；ERLIN1上游引物序列為 5′-GCGAAAGCAGATGCTGAATAT-3′，下游引物序列為5′-ATATTCAGCATCTGCTTTCGC-3′；U6上游引物序列為5′-TTACATTGCTATCCACAGAACGG-3′，下游引物序列為5′-CTATGCTGCTGCTTTTTGCTC-3′；β-actin上游引物序列為5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物序列為5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′。以U6為miR-152的內(nèi)參，以β-actin為ERLIN1的內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算Nthy-ori 3-1、TPC-1細胞中miR-152相對表達量和TPC-1細胞中ERLIN1 mRNA相對表達量。

1.2.4 四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法檢測各組TPC-1細胞增殖能力取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的TPC-1細胞，調(diào)整細胞密度為 1×108L-1，接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，MTT比色法檢測各組細胞增殖能力，各組設6個平行孔，每孔加入 20 μL MTT，于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，每孔加入 200 μL 二甲基亞砜，用酶標儀測波長570 nm處的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率=(l-吸光度實驗組/吸光度對照組)×100%。實驗重復6次，取均值。

1.2.5 平板克隆形成實驗檢測各組TPC-1細胞增殖能力取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的TPC-1細胞，調(diào)整細胞密度為1×106L-1，接種至培養(yǎng)皿中，各組設6個平行孔。當克隆細胞肉眼可見時，棄去培養(yǎng)基，結晶紫染色、沖洗，晾干后用相機拍照并計數(shù)細胞克隆數(shù)。實驗重復6次，取均值。

1.2.6 流式細胞術檢測各組TPC-1細胞凋亡情況收集各組TPC-1細胞，調(diào)整細胞密度為1×109L-1的細胞懸液，取100 μL細胞懸液加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexinV-fluoreseein isothiocyanate,AnnexinV-FITC)和5 μL碘化丙啶(propidium lodide,PI)混勻，室溫避光孵育15 min后，流式細胞儀進行檢測。實驗重復6次，取均值。

1.2.7 Transwell實驗檢測各組TPC-1細胞遷移、侵襲能力收集各組TPC-1細胞，調(diào)整細胞密度為2×108L-1，接種于Transwell上室，下室加 250 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分數(shù) 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，40 g·L-1多聚甲醛固定，結晶紫染色，于倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察并計算細胞遷移數(shù)。細胞侵襲能力檢測：制備50 μL Matrigel膠(200～300 mg·L-1)，鋪在Transwell小室的上室，待Matrigel膠凝固，后續(xù)操作步驟與細胞遷移能力檢測一致，并計算細胞侵襲數(shù)。

1.2.8 Western blot法檢測各組TPC-1細胞中ERLIN1 蛋白表達提取各組TPC-1細胞總蛋白，二喹啉甲酸法測其濃度，按每孔30 μg蛋白上樣，進行電泳分離、轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入一抗(抗ERLIN1、β-actin抗體，11 000)，4 ℃過夜培養(yǎng)，次日加二抗(15 000)，溫室培養(yǎng)1 h，洗膜，滴加增強化學發(fā)光液進行顯色，掃描膠片，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞中miR-152相對表達量比較結果見表1。空白對照組、miR-con組、miR-152組TPC-1細胞中miR-152相對表達量顯著低于Nthy-ori 3-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-152組TPC-1細胞中miR-152相對表達量顯著高于空白對照組和miR-con組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與miR-con組 TPC-1細胞中miR-152相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 4組細胞中miR-152相對表達量比較

2.2 過表達miR-152對TPC-1細胞增殖能力的影響結果見圖1和表2。與空白對照組、miR-con組比較，miR-152組TPC-1細胞增殖抑制率顯著升高，細胞克隆數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與miR-con組TPC-1細胞增殖抑制率和細胞克隆數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 3組TPC-1細胞克隆情況

表2 3組TPC-1細胞增殖能力比較

2.3 過表達miR-152對TPC-1細胞凋亡的影響結果見圖2和表3。miR-152組TPC-1細胞凋亡率顯著高于空白對照組和miR-con組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與miR-con組TPC-1細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 流式細胞術檢測3組TPC-1細胞凋亡情況

表3 3組TPC-1細胞凋亡率比較

2.4 過表達miR-152對TPC-1細胞遷移、侵襲能力的影響結果見圖3和表4。miR-152組TPC-1細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)均顯著低于空白對照組和miR-con組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與miR-con組TPC-1細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 3組TPC-1細胞遷移、侵襲能力

表4 3組TPC-1細胞遷移、侵襲能力比較

2.5 過表達miR-152對TPC-1細胞中ERLIN1 mRNA及蛋白表達的影響結果見圖4和表5。miR-152組TPC-1細胞中ERLIN1 mRNA及蛋白相對表達量均顯著低于空白對照組和miR-con組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組與miR-con組TPC-1細胞中ERLIN1 mRNA及蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4 3組TPC-1細胞中ERLIN1蛋白表達(Western blot)

表5 3組TPC-1細胞中ERLIN1 mRNA及蛋白相對表達量比較

3 討論

PTC是一種分化型甲狀腺癌，占甲狀腺癌的85%～90%，大部分PTC患者具有較好的預后，但PTC較易發(fā)生頸部淋巴結轉(zhuǎn)移，導致患者復發(fā)及再手術風險增加，是造成甲狀腺癌病死率升高的主要原因[6-8]。隨著生物技術的不斷發(fā)展和人們對非編碼RNA的認識，大量研究表明，miRNA不僅可以調(diào)節(jié)基因表達，還參與調(diào)節(jié)細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡等多種生物過程，miRNA異常表達與心血管疾病、肝癌、PTC等多種疾病的發(fā)生有關[9-12]。胡仿玲等[13]研究報道，miRNA與PTC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移相關，可作為診治PTC的生物標志物。因此，從分子水平研究PTC的發(fā)病機制，尋找其藥物治療的新靶點，對PTC患者臨床治療具有重要意義。

miR-152屬于miR-148/miR-152家族，在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等多種癌組織和細胞中低表達，其表達與癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程密切相關[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Nthy-ori 3-1組相比，空白對照組、miR-con組、miR-152組TPC-1細胞中miR-152表達水平顯著降低，提示miR-152與PTC疾病的發(fā)生密切相關。XIE等[17]研究表明，miR-152是一種腫瘤抑制因子，miR-152過表達可以抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-152組TPC-1細胞中miR-152相對表達量顯著高于空白對照組和miR-con組，提示過表達miR-152的TPC-1細胞株構建成功。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組、miR-con組相比，miR-152組TPC-1細胞中細胞增殖抑制率顯著升高，細胞克隆數(shù)顯著減少，提示miR-152過表達可以抑制TPC-1細胞增殖。周文賓等[18]研究顯示，在腎癌細胞中，過表達miR-152可以降低細胞的存活率，促進細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-152組TPC-1細胞凋亡率顯著高于空白對照組和miR-con組，提示miR-152表達升高可以促進TPC-1細胞凋亡。HE等[19]研究顯示，miR-152表達與垂體腺癌細胞侵襲、遷移能力密切相關。本研究結果顯示，miR-152組TPC-1細胞的遷移數(shù)、侵襲數(shù)均顯著低于空白對照組和miR-con組，提示過表達miR-152可抑制TPC-1細胞遷移、侵襲。

ERLIN1基因?qū)儆趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)筏相關蛋白家族，是膽固醇結合蛋白，與體內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)平衡、病毒感染后RNA復制及感染性病毒的產(chǎn)生有關[20-21]。吳賀文[22]研究表明，ERLIN1在乳腺癌細胞中高表達可影響細胞生長、侵襲、遷移等生物過程，miR-410可以靶向負調(diào)控ERLIN1。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-152組TPC-1細胞中ERLIN1 mRNA及蛋白相對表達量顯著低于空白對照組和miR-con組，提示miR-152可能通過靶向調(diào)控ERLIN1的表達來抑制TPC-1細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡。

綜上所述，miR-152在TPC-1細胞中低表達，其可能通過靶向負調(diào)控ERLIN1的表達來影響細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物過程，從而參與PTC的進展和轉(zhuǎn)移。但miR-152與ERLIN1在PTC中作用的具體機制仍需進一步研究來驗證。