龍林 黃盼 程佩佩 李清安 劉源才 胡輝

【摘要】目的 建立覆盆子配方顆粒指紋圖譜檢測方法。方法 采用HPLC對(duì)覆盆子配方顆粒中指紋圖譜的檢測方法進(jìn)行研究，并建立覆盆子配方顆粒指紋圖譜。結(jié)果 通過考察色譜柱、流動(dòng)相、檢測波長、供試品溶劑等因素，確定了覆盆子指紋圖譜的最優(yōu)色譜條件。在此條件下，對(duì)10批次覆盆子配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行考察，結(jié)果顯示供試品在鞣花酸、椴樹苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷3個(gè)對(duì)照品相應(yīng)位置，都有清晰的色譜峰，各批次之間指紋圖譜相似度在97.3%以上。結(jié)論 本研究完成了覆盆子配方顆粒指紋圖譜檢測方法的開發(fā)，并制定了相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，可應(yīng)用于覆盆子配方顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】覆盆子;配方顆粒;HPLC;鞣花酸;山柰酚-3-O-蕓香糖苷;指紋圖譜

【中圖分類號(hào)】R97 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）09--02

覆盆子，又名樹莓，是薔薇科植物華東覆盆子 Rubus chingii Hu 的干燥果實(shí)，夏初果實(shí)由綠變綠黃時(shí)采收。具有益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目的功效。用于遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明覆盆子有顯著的抗腫瘤、抗氧化、降低血糖血脂、抗衰老、抗炎和免疫增強(qiáng)等藥理作用[2-3]。鞣花酸和山柰酚-3-O-蕓香糖苷為2015年版藥典規(guī)定覆盆子含量測定的指標(biāo)成分，椴樹苷為薄層鑒別的標(biāo)志成分。鞣花酸具有抑制癌變和清除致癌毒素的作用;椴樹苷具有消炎、強(qiáng)心、利尿和抗氧化等藥理活性;山柰酚-3-O-蕓香糖苷在適宜劑量時(shí)具有急性應(yīng)激誘導(dǎo)的作用 [4-5]。除此之外，覆盆子還被世界糧農(nóng)組織（FAO）推薦為第三代黃金水果[6]，在國內(nèi)外市場上應(yīng)用前景非常廣闊，價(jià)格也逐年走高[7]。中藥配方顆粒作為中藥飲片的補(bǔ)充，因其攜帶方便，免煎服用等優(yōu)點(diǎn)逐漸被臨床認(rèn)可[8-9]。覆盆子作為一個(gè)常用的大宗藥材，兼具藥食兩用的功能，其配方顆粒的應(yīng)用也非常廣泛。本研究參照中國藥典2015年版一部覆盆子項(xiàng)下的規(guī)定，以覆盆子配方顆粒為原料，通過高效液相色譜等技術(shù)對(duì)覆盆子配方顆粒的特征圖譜進(jìn)行研究，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1200系列高效液相色譜儀（Agilent），Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters）;AB135-S型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）;Option-Q系列純水機(jī)（ELGA）;ZF-90型暗箱式紫外分析儀（上海五相儀器儀表有限公司）。

鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)111959-201501，含量97.0%）、椴樹苷對(duì)照品（批號(hào)112000-201501，含量98.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院;山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品（批號(hào)16070401，含量98.0%）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;乙腈、磷酸為色譜純;其他試劑均為分析純;10批覆盆子配方顆粒（批號(hào)：P20160907，P20160908，P20160909，P20160913，P20160914，P20160917，P20160918，P20160919，P20160921，P20160922，勁牌持正堂藥業(yè)有限公司）;覆盆子飲片（批號(hào)：160101，湖北正光九資河藥業(yè)有限公司。經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院梅之南教授鑒定為：薔薇科植物華東覆盆子 Rubus chingii Hu的干燥果實(shí)覆盆子）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測方法概要

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.1%磷酸水溶液按下表進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為270nm，進(jìn)樣體積為10μl。理論板數(shù)按鞣花酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

對(duì)照品溶液的制備 分別取鞣花酸對(duì)照品、椴樹苷對(duì)照品、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加20%甲醇分別制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備 取本品粉末約100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入20%甲醇溶解，定容，混勻，以針頭過濾器過濾，即得。

2.2 流動(dòng)相考察 分別選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過比較不同洗脫系統(tǒng)的指紋圖譜，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

2.3 檢測波長的考察 根據(jù)覆盆子中有效成分紫外吸收的吸收峰特征，分別測定了不同波長為250nm、270nm、290nm、360nm的圖譜。從圖譜可知270nm的響應(yīng)值相對(duì)較好，所以確定覆盆子配方顆粒的指紋圖譜檢測波長為270nm。

2.4 溶劑的考察 分別選擇20%甲醇、50%甲醇、水、20%乙醇、50%乙醇溶解樣品，考察最佳溶解溶劑。從圖譜可知20%甲醇溶解指紋圖譜效果相對(duì)較好，所以確定覆盆子配方顆粒的溶劑為20%甲醇。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液及供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同的保留時(shí)間上都有色譜峰，該方法專屬性良好。

2.6 儀器精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果相似度都在99.8%以上，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的覆盆子配方顆粒，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下測定，結(jié)果相似度都在99.9%以上，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別在0 h，2.5 h，5 h，10 h，15 h，20 h進(jìn)樣，結(jié)果相似度都在99.7%以上，表明20 h內(nèi)測定，樣品溶液穩(wěn)定。

2.9 耐用性考察 采用同一臺(tái)儀器Agilent 1260系列高效液相色譜儀、相同的色譜分析條件，不同的色譜柱對(duì)同一樣品進(jìn)行色譜分析。分析用的色譜柱如下：Waters T3 色譜柱（4.6×250mm，5μm）、Sepax HP-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）、Agilent SB-Aq C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）。由譜圖可知，從分離效果來看，Waters T3色譜柱的分離效果最佳。

2.10 樣品的檢測 對(duì)收集的10批覆盆子配方顆粒樣品按照上述色譜條件進(jìn)行了指紋圖譜考察，其疊加圖譜見圖4。通過對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)了鞣花酸、椴樹苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷共3個(gè)特征共有峰，生成的對(duì)照指紋圖譜見下圖4。結(jié)果表明，各批次的覆盆子配方顆粒相互之間的相似度均在97.3%以上，說明各批次覆盆子配方顆粒穩(wěn)定性良好，并且具備整體系統(tǒng)性和單味覆盆子配方顆粒的特征性。

3 討論

根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，覆盆子中的主要化學(xué)成分有二萜（ 苷） 、三萜（ 苷） 、黃酮（ 苷） 、甾體、生物堿等。本方法參考《中國藥典》2020年版一部覆盆子【含量測定】項(xiàng)下方法，通過考察色譜柱、流動(dòng)相、檢測波長、供試品溶劑等因素，確定了覆盆子指紋圖譜的最優(yōu)色譜條件。在此條件下，對(duì)10批次覆盆子配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行考察，結(jié)果顯示供試品在鞣花酸、椴樹苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷3個(gè)對(duì)照品相應(yīng)位置，都有清晰的色譜峰。

采用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)（2012版）》，以S1液相圖譜為參照?qǐng)D譜，將10批覆盆子配方顆粒HPLC圖譜色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，形成共有峰模式圖，結(jié)果10批覆盆子配方顆粒干膏粉供試品中均呈現(xiàn)出多個(gè)共有峰，各批次之間相似度良好（均在97.3%以上），具有良好的穩(wěn)定性和特征性。據(jù)此，暫定覆盆子配方顆粒指紋圖譜相似度≥90%。

綜上所述，本研究完成了覆盆子指紋圖譜檢測方法地開發(fā)，并制定了相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和限度要求，可應(yīng)用于覆盆子配方顆粒的質(zhì)量控制。

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第一作者：龍林，男，碩士，工程師，研究方向：中藥資源與中藥制劑，E-mail：364003726@qq.com

通訊作者：胡輝，男，學(xué)士，工程師，研究方向：中藥資源與中藥制劑，E-mail：15972368370@qq.com

基金項(xiàng)目：湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020ACA019）