佟 斌，李 虹，孫 波

（黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱150040）

0 引言

藍莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物。果實中營養(yǎng)豐富，并且具增強免疫力、預防疾病等多種功能[1-3]。全球杜鵑花科越橘屬植物種類繁多，中國自然分布一種為篤斯越橘（野生藍莓），在大、小興安嶺等地區(qū)分布，引進品種較多[4-5]。在北方高寒地區(qū)由于低溫等制約因素，致使大多引進的藍莓品種產(chǎn)生凍害，生長緩慢[6-10]。在實際栽培時多進行防寒處理，增加了藍莓的生產(chǎn)成本，嚴重影響北方高寒地區(qū)藍莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[11-16]。因此，開展藍莓的抗寒性研究對北方地區(qū)藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

藍莓‘興安1號’由大興安嶺野生藍莓為母本、美國矮叢藍莓為父本進行雜交獲得，于2013年12月25日經(jīng)國家林業(yè)局審定授予藍莓植物新品種。田間栽培顯示與野生藍莓相比，‘興安1號’藍莓的性狀表現(xiàn)更優(yōu)秀，單株果實產(chǎn)量也有所增加。而抗寒能力的強弱成為雜交藍莓新品種推廣應用的關(guān)鍵因素之一[17]。因此本研究利用人工防寒馴化方法，選取藍莓‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓為試驗材料，通過盆栽防寒試驗，設(shè)置差異處理梯度，對比不同藍莓品種的生理、生化特征，結(jié)合隸屬函數(shù)法進行綜合評估，衡量‘興安1號’的抗寒能力，以期為雜交藍莓新品種的應用推廣與規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理方法

2019年3月將‘興安1號’藍莓、野生藍莓、美國矮叢藍莓3年生組培苗定植于黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所實驗基地內(nèi)。2019年10月選擇生長勢均一的苗木栽于盆中，置于室外自然環(huán)境條件下正常管理養(yǎng)護。

2019年11月中旬，利用室外自然低溫脅迫。防寒措施采取深坑覆土的方式，設(shè)置輕度低溫脅迫（藍莓株高30%露出地面）、中度低溫脅迫（藍莓株高60%露出地面）、重度低溫脅迫（藍莓株高90%露出地面）、對照（不覆土）4個梯度，每個梯度處理30株。

1.2 指標測定方法

確定采樣期為溫度最低的2020年1月，選擇同規(guī)格藍莓盆栽苗10株，每株在相同樹冠部位采樣，選取成熟度一致、深休眠期未受凍傷的枝條，用以測定各項指標。采用硫代巴比妥酸法[18]測定藍莓枝條丙二醛含量，采用電導法[19]測定藍莓枝條電導率，參照Jin等[20]的方法測定藍莓枝條H2O2含量，參照Huang等[21]的方法測定藍莓枝條O2-含量，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法[22]測定藍莓ABA含量。

1.3 抗寒性的評估方法

生理抗寒性的評估采用隸屬函數(shù)法[23-24]，可有效消除單一指標的片面性結(jié)論，計算如式(1)～(2)。

式中，i為藍莓類別，j為具體特定指標，Xjmin為全類別特定指標的最低極限值，Xjmax為全類別特定指標的最高極限值，Uij為i類別j指標的抗寒性隸屬函數(shù)值，Xij為i類別j指標的值。

權(quán)重計算采用客觀賦權(quán)法，以無量綱數(shù)Ij反映低溫脅迫下特定指標值與對照的比值，如式(3)～(4)。歸一化得到指標權(quán)重Wj，如式(5)。抗寒性綜合評估如式(6)。

式中，Cj表示第j項指標實測值，Sj表示第j項指標均值。

1.4 田間試驗的觀測方法

2019年3月與盆栽試驗均在黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所實驗基地內(nèi)，將‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓3年生苗木定植于田間，株行距0.7 m×1.5 m，采用隨機區(qū)組設(shè)計。土壤有機質(zhì)含量5%～12%，pH 4.5～6.0，土壤濕度20%～80%。至2020年5月初為止定期統(tǒng)計株高、冠幅、植株存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對藍莓枝條相對電導率的影響

如圖1所示，在輕度低溫脅迫條件下，藍莓的相對電導率變化不顯著；中度低溫脅迫條件下，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的相對電導率與對照相比均有所提高，幅度在154.4%～450%；在重度低溫脅迫條件下，3種藍莓的相對電導率提升幅度更大，達到297.6%～450%。由此可知，藍莓枝條的相對電導率受低溫脅迫影響較明顯，以美國矮叢藍莓的變化幅度最為顯著。

圖1 低溫脅迫對藍莓枝條相對電導率的影響

2.2 低溫脅迫對藍莓枝條丙二醛(MDA)含量的影響

如圖2所示，藍莓的MDA含量的變化與低溫脅迫程度的加劇呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。在重度低溫與中度低溫脅迫條件下，與對照相比，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的MDA含量均有大幅提升，差異性達到極顯著水平。由此可見，一定程度的低溫脅迫下，野生藍莓、‘興安1號’的變化幅度比美國矮叢藍莓低，可以推測低溫脅迫對其質(zhì)膜傷害程度相對較小。

圖2 低溫脅迫對藍莓枝條MDA含量的影響

2.3 低溫脅迫對藍莓枝條的H2O2含量的影響

如圖3所示，在低溫脅迫條件下，H2O2含量隨著脅迫程度的加劇呈顯著上升趨勢。在輕度低溫脅迫條件下，與對照相比，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的H2O2含量不存在顯著差異。而在重度低溫脅迫條件下，與對照相比，藍莓的H2O2含量都顯著提高，差異達到極顯著水平。

圖3 低溫脅迫對藍莓枝條H2O2含量的影響

2.4 低溫脅迫對藍莓枝條的O2-速率的影響

如圖4所示，在低溫脅迫條件下，O2-速率隨著脅迫程度的加劇顯著上升。在輕度低溫脅迫條件下，與對照相比，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的O2-速率不存在顯著差異。而在重度低溫脅迫條件下，與對照相比，藍莓的O2-速率都顯著提高，差異達到極顯著水平。在同一程度的低溫脅迫下，不同品種的藍莓的O2-速率變化不同。

圖4 低溫脅迫對藍莓枝條O2-速率的影響

2.5 低溫脅迫對藍莓枝條的ABA含量的影響

如圖5所示，在低溫脅迫條件下，ABA含量隨著脅迫程度的加劇呈現(xiàn)顯著上升趨勢。在輕度低溫脅迫條件下，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的ABA含量與對照之間顯著不差異。而在中度、重度低溫脅迫條件下，與對照相比，藍莓的ABA含量都顯著提高，差異達到極顯著水平。

圖5 低溫脅迫對藍莓枝條ABA含量的影響

2.6 藍莓的抗寒性評估

基于隸屬函數(shù)的上述各指標的加權(quán)平均值對各藍莓品種抗寒性進行綜合評估（表1）。經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)，MDA含量、相對電導率、O2-速率的權(quán)重值較大，推測可能與藍莓抗寒性緊密相關(guān)。經(jīng)過綜合評估值的計算3種藍莓抗寒性有強到弱表現(xiàn)為‘興安1號’>野生藍莓>美國矮叢。

表1 藍莓的抗寒性評估

2.7 田間試驗驗證結(jié)果

2019—2020年試驗時間內(nèi)哈爾濱市冬季平均氣溫為-12.7℃，平均降雪量為4.9 mm，接近于該地區(qū)歷史平均值。該地區(qū)總體氣候環(huán)境優(yōu)于野生藍莓自然分區(qū)地區(qū)，劣于美國矮叢藍莓引種地氣候環(huán)境。在哈爾濱越冬時冬季溫度成為藍莓生長的主要限制因子。由表2可知‘，興安1號’、野生藍莓的存活率顯著高于美國矮叢藍莓；‘興安1號’藍莓的冠幅明顯高于野生藍莓和美國矮叢藍莓；3個品種的株高野生藍莓、‘興安1號’藍莓數(shù)值高于美國矮叢藍莓?？傮w來說，田間試驗與指標抗寒性綜合評估結(jié)果趨于一致。

表2 田間栽培條件下低溫對3個藍莓品種的生長影響

3 結(jié)論

本研究基于人工防寒馴化方法，利用隸屬函數(shù)法，以田間實驗和生理指標相互驗證為切入點進行研究。在中度低溫脅迫條件下，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的相對電導率與對照相比均有所提高。在重度低溫脅迫條件下，3種藍莓的相對電導率提升幅度增加；藍莓的MDA含量的變化與低溫脅迫程度的加劇呈顯著的正相關(guān)。在重度低溫與中度低溫脅迫條件下，與對照相比，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的MDA含量均有大幅度的提升，差異性達到極顯著水平；H2O2含量隨著脅迫程度的加劇呈顯著上升趨勢。在重度低溫脅迫條件下，與對照相比，藍莓的H2O2含量顯著提高，差異達到極顯著水平；藍莓O2-速率隨著脅迫程度的加劇呈顯著上升趨勢。在輕度低溫脅迫條件下，與對照相比，‘興安1號’、野生藍莓、美國矮叢藍莓的O2-速率不存在顯著差異。在重度低溫脅迫條件下，與對照相比，藍莓的O2-速率顯著提高，差異達到極顯著水平；ABA含量隨著脅迫程度的加劇呈現(xiàn)顯著上升趨勢。在中度、重度低溫脅迫條件下，與對照相比，藍莓的ABA含量顯著提高，差異達到極顯著水平。通過藍莓的抗寒性評估MDA含量、相對電導率、O2-速率在5種生理指標中的權(quán)重值較大，‘興安1號’抗寒能力總體優(yōu)于野生藍莓、美國矮叢藍莓。田間試驗結(jié)果表明‘興安1號’、野生藍莓的自然越冬存活率顯著高于美國矮叢與藍莓生理指標表現(xiàn)和抗寒性綜合評估結(jié)果趨于一致。

4 討論

在低溫條件下，植物細胞質(zhì)膜是植物最先受到傷害的部位，可使質(zhì)膜的透性增加、電解質(zhì)滲出。質(zhì)膜傷害越小植物的抗寒性越強，細胞膜的滲出率與植物御寒能力呈現(xiàn)負相關(guān)的趨勢，與本試驗測得MDA含量與相對電導率數(shù)據(jù)所呈現(xiàn)的規(guī)律相同?！澳ぶ嘧儭睂W說被稱為近代植物抗寒性機理研究的奠基石[19]。低溫脅迫阻礙了植物體內(nèi)活性氧自由基的代謝，導致細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除紊亂從而形成積累。這在藍莓中已有報道[6,16,23]。在本實驗中3個藍莓品種H2O2含量與O2-含量均隨低溫脅迫程度的加劇而呈上升趨勢，推測可能是引起藍莓膜脂過氧化程度、質(zhì)膜透性等參數(shù)呈差異化表現(xiàn)的主要根源[27]。經(jīng)生理指標的綜合分析可知，美國矮叢藍莓的變化幅度相較‘興安1號’藍莓和野生藍莓大，由此推斷，低溫脅迫對美國矮叢藍莓的傷害程度較大，‘興安1號’藍莓和野生藍莓抗寒性相對較強。低溫脅迫對于資源植物的影響是多樣化的，眾多學者針對藍莓等資源植物的抗寒性鑒定主要集中在生理、生化指標[14-17,25]。評估依據(jù)總體上可歸納為生理化指標、農(nóng)藝性狀參數(shù)及解剖結(jié)構(gòu)等[26]，然而，所得結(jié)論各不相同。有學者針對‘美登’、‘北陸’、‘藍豐’、‘密斯梯’等藍莓品種的抗寒性分析表明，LT50值、MDA含量變化量、保護酶活性與4個藍莓品種的抗寒性最為密切相關(guān)[25]。龔月樺等[22]對美國黃松、班克松和油松的抗寒性研究表明，生理生化指標對其的影響顯著大于農(nóng)藝性狀指標。本研究3個藍莓品種5個生理化指標在低溫脅迫下均呈現(xiàn)不同程度的變化，與3種藍莓抗寒性相對較緊密的指標依次為MDA含量、相對電導率、O2-速率。由此可知，藍莓的抗寒性評估趨向于綜合生理指標結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)指標等。植物的抗逆性反映了植物在逆境脅迫條件下的生存、成長及繁育能力，是多重因素復合作用的集合機制。到目前為止領(lǐng)域內(nèi)尚未形成合理的、標準化的方法[28]。因此，僅著眼于單一因素而試圖評估資源植物的抗寒性，存在若干局限性。參考前人的研究成果，隸屬函數(shù)分析在一定程度上實現(xiàn)了基于多指標測定的針對目標對象的綜合性評估，其鑒定評估的準確性相對較高[29-30]。

本研究共測定了3個藍莓品種的5個主要抗性生理指標，指標種類不夠全面。分析了不同低溫處理梯度下各藍莓品種的指標變化規(guī)律，但其中3個藍莓品種的若干指標之間的變化趨勢呈現(xiàn)出不一致的復雜性，各指標的增幅排序就各有差異，如MDA含量與O2-含量。對于其內(nèi)部機理探究不深，更多地應用了前人的研究成果對本試驗進行論證。對生理指標進行客觀賦權(quán)方式結(jié)合隸屬函數(shù)對3個藍莓品種抗寒性進行了綜合評估，一定程度上仍存在評估中的主觀隨意性。3年生藍莓仍處于植株的苗期，應用短時間的試驗數(shù)據(jù)研究各品種藍莓的抗寒能力并不夠詳實?！d安1號’藍莓是一個優(yōu)良的雜交藍莓新品種，本研究旨在對其環(huán)境適應性進行一定的了解，為‘興安1號’藍莓在北方高寒地區(qū)應用與推廣提供一定理論參考。