魏夢霞 紀(jì)樹欽 李子杰 林子逸 MONTARDY Quentin 王立平,4,5,6* 李 蕾,4,5,6*

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

3(香港浸會大學(xué) 香港 999077)

4(深港腦科學(xué)創(chuàng)新研究院 深圳 518055)

5(中國科學(xué)院腦聯(lián)結(jié)解析與調(diào)控重點實驗室 深圳 518055)

6(廣東省腦連接圖譜重點實驗室 深圳 518055)

1 引 言

前庭系統(tǒng)幾乎是所有哺乳動物平衡系統(tǒng)的重要組成部分。前庭系統(tǒng)內(nèi)具有特殊的感受器，在一定的刺激下產(chǎn)生神經(jīng)沖動，經(jīng)前庭神經(jīng)傳入相應(yīng)的部位，其中最主要的是位于腦干的前庭神經(jīng)核(Vestibular Nuclei，VN)與小腦。前庭神經(jīng)核位于第四腦室底前庭區(qū)，由于細(xì)胞構(gòu)筑與纖維聯(lián)系的不同，其可分為內(nèi)側(cè)核、下核、外側(cè)核和上核。隨著對包括前庭神經(jīng)核在內(nèi)的前庭系統(tǒng)解剖學(xué)及功能研究的深入，其在姿勢、動眼神經(jīng)反射、空間表征及認(rèn)知中的功能逐步被證實[1]。當(dāng)軀體產(chǎn)生位移時，頭部加速度被位于內(nèi)耳感覺器中的機械敏感性毛細(xì)胞檢測到并編碼為感覺信息電信號，之后通過前庭神經(jīng)傳遞至腦干的前庭神經(jīng)核。該基本感覺信息在前庭神經(jīng)核內(nèi)被整合并轉(zhuǎn)換為運動前信號，通過前庭脊髓束和前庭動眼神經(jīng)通路來執(zhí)行其功能。前庭神經(jīng)核內(nèi)的神經(jīng)元可通過內(nèi)側(cè)縱束投射到動眼神經(jīng)核并在頭部運動期間控制視線的穩(wěn)定。另外，前庭神經(jīng)核還可通過兩個下行途徑到達(dá)脊髓來影響姿勢控制[2]。前庭信息也通過前庭-丘腦-皮質(zhì)通路將整合后的信息轉(zhuǎn)移到不同的皮質(zhì)區(qū)域，這些高級腦結(jié)構(gòu)區(qū)域提供感知和認(rèn)知功能[3-4]。此外，在結(jié)構(gòu)上，前庭神經(jīng)核與腦干中的多個植物神經(jīng)中心相互連接[5-6]。

前庭神經(jīng)核功能異常與暈動病、前庭偏頭疼、焦慮癥和帕金森氏病(Parkinson’s Disease)等疾病相關(guān)[7-9]。但前庭神經(jīng)核與上述疾病的關(guān)聯(lián)神經(jīng)機制尚不清楚，尤其是其上下游神經(jīng)環(huán)路機制仍需要深入的研究[10-11]。作為保持平衡的核心腦區(qū)，前庭神經(jīng)核接受廣泛的神經(jīng)信息輸入和輸出[12]。其中，前庭神經(jīng)核與腦干另外一個核團(tuán)——藍(lán)斑(Locus Coeruleus，LC)的結(jié)構(gòu)及功能關(guān)聯(lián)具有特殊及重要的生理學(xué)意義。暈動病通常包括惡心、嘔吐、冷汗、頭痛、困倦、打哈欠、食欲不振和流涎增加等癥狀。在模擬暈動病相關(guān)反應(yīng)的動物實驗中，對大鼠進(jìn)行逆行向心加速處理后，發(fā)現(xiàn)前庭神經(jīng)核及藍(lán)斑均被該處理激活[13]。Balaban 等[7]利用貓的前庭神經(jīng)核電刺激范式研究了與暈動病相關(guān)的腦區(qū)激活，結(jié)果顯示，由藍(lán)斑、前庭神經(jīng)核、外側(cè)孤束核、內(nèi)側(cè)臂旁核和導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)組成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)被激活。前庭偏頭痛是一種常見的疾病，遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素均可促進(jìn)其發(fā)生、發(fā)展，但相應(yīng)病理生理機制尚不清楚。有研究指出，腦干前庭神經(jīng)核與調(diào)節(jié)三叉神經(jīng)傷害性輸入的結(jié)構(gòu)，如延髓吻側(cè)腹內(nèi)側(cè)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)、藍(lán)斑和中縫核之間的相互連接對理解前庭偏頭痛的病理生理學(xué)至關(guān)重要[14]。頭暈、眩暈、失衡及廣泛性焦慮癥在老年人中很常見。盡管已有焦慮癥與前庭功能異常的共患報道，但其機制仍不清楚，在臨床應(yīng)用上也還沒有關(guān)于前庭神經(jīng)核與焦慮癥相關(guān)的進(jìn)一步研究進(jìn)展[8]。在帕金森氏病和路易體癡呆中，相關(guān)的細(xì)胞分子標(biāo)記物異常，如路易體及路易神經(jīng)突在藍(lán)斑和前庭神經(jīng)核中有表達(dá)，并且可能與步態(tài)和姿勢不穩(wěn)、平衡問題及跌倒等帕金森氏病和路易體癡呆的癥狀相關(guān)[15]。實際上，在平衡障礙相關(guān)疾病、空間與運動體征異常及情緒異常的合并機制方面，有研究提出這些疾病共患的機制可能在于前庭-臂旁核網(wǎng)絡(luò)、大腦皮層網(wǎng)絡(luò)、網(wǎng)狀核-前庭網(wǎng)絡(luò)以及藍(lán)斑-前庭神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的異常[12]。此外，大量臨床證據(jù)表明前庭功能障礙和暈動病均具有自主神經(jīng)表現(xiàn)，如上腹不適、惡心、嘔吐等，最終向條件性厭惡或恐懼癥發(fā)展。但前庭輸入在自主神經(jīng)調(diào)節(jié)中的重要性尚不清楚[6]。鑒于藍(lán)斑與自主神經(jīng)系統(tǒng)的密切聯(lián)系，深入研究藍(lán)斑與前庭神經(jīng)核的相互關(guān)聯(lián)可能為這種伴隨前庭功能障礙的內(nèi)臟不適提供新的思路和證據(jù)。

作為大腦內(nèi)合成去甲腎上腺素的主要部位[16-17]，藍(lán)斑介導(dǎo)了壓力應(yīng)激反應(yīng)，并與注意、喚醒、記憶等生理功能密切相關(guān)[18-22]。諸多神經(jīng)精神疾病，如焦慮癥、恐慌癥、抑郁癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、注意缺陷多動障礙和阿爾茨海默病中都存在藍(lán)斑去甲腎上腺素能系統(tǒng)的失調(diào)[19-20,23-25]。研究證明，藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元的激活導(dǎo)致動物出現(xiàn)焦慮樣行為[22]且對后續(xù)動物的行為輸出具有神經(jīng)調(diào)制作用[26]。另有實驗證明，間歇性短暫睡眠會導(dǎo)致藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元表現(xiàn)出持續(xù)的形態(tài)改變和細(xì)胞數(shù)量的減少[27]；且睡眠剝奪合并線性振蕩對暈動病具有加劇的作用[28]。本文研究利用野生型小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠，通過腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)示蹤研究藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的神經(jīng)投射，并利用免疫熒光染色來確定相關(guān)神經(jīng)元的類型；同時，在睡眠剝奪的壓力模型中檢測藍(lán)斑及前庭神經(jīng)核的激活情況。

2 材料和方法

2.1 材料

實驗所用小鼠均飼養(yǎng)在無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)動物飼養(yǎng)間內(nèi)，照明周期為 12 h 光照/12 h 黑暗交替循環(huán)，期間保證飼料與飲水充足。動物實驗方案經(jīng)中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動物倫理委員會審查通過(SIAT-IACUC-190226-NS-LL-A0648)。實驗所用 CD1-TH-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠 7 只，8 周齡；野生型 C57BL/6J 小鼠 8 只，14 周齡。其中，CD1-TH-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠父本為 TH-cre-C57/6N，母本為 CD-1(ICR)，實驗所用動物為上述父本與母本交配產(chǎn)生的 F1 代轉(zhuǎn)基因小鼠。野生型 C57BL/6J小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2.2 小鼠腦內(nèi)病毒注射

向 CD1-TH-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射戊巴比妥溶液(80 mg/kg)以對其進(jìn)行麻醉，待確認(rèn)其達(dá)到深度麻醉后，采用剃發(fā)器除去頭部表面毛發(fā)，隨后將其放置并固定在腦立體定位儀(瑞沃德)上。用酒精消毒小鼠頭部剃發(fā)區(qū)后，剪開頭皮暴露顱骨骨縫，以前囟(Bregma 點)和后囟(Lambda點)為參考點，將前囟作為坐標(biāo)原點，經(jīng)過反復(fù)調(diào)整直至小鼠腦在前、后、左、右均處在水平位置。調(diào)節(jié)腦立體定位儀，使用微型手持式顱鉆對目標(biāo)腦區(qū)正上方顱骨進(jìn)行打孔，再用預(yù)先吸好病毒的注射針緩慢下降到目標(biāo)腦區(qū)并用微量注射泵(Hamilton)以 100 nL/min 的速度注射病毒。待注射結(jié)束后停針 10 min，接著將針頭緩慢上升并移出動物腦部，使用碘伏擦拭顱骨，同時用可吸收縫線對小鼠頭皮傷口進(jìn)行縫合并消毒。

本實驗的病毒注射位置坐標(biāo)為藍(lán)斑(AP:－5.30 mm,ML:0.80 mm,DV:－4.00 mm)。本實驗對 CD1-TH-cre 小鼠注射病毒 AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA，滴度為 1×1013v.g./mL(Vector Genomes per mL)，每只小鼠于目標(biāo)位點注射 100 nL。

2.3 小鼠睡眠剝奪壓力范式

將野生型 C57BL/6J 小鼠分為兩組(對照組 4只，實驗組 4 只)。實驗組小鼠使用睡眠剝奪儀進(jìn)行 24 h 的睡眠剝奪壓力處理(運行速度為 3.5 r/min，徠越 SD1900)，實驗期間確保糧水供給。對照組小鼠也同時從飼養(yǎng)架轉(zhuǎn)移到行為間，但不進(jìn)行睡眠剝奪處理。實驗結(jié)束后，對所有小鼠進(jìn)行麻醉、灌流及犧牲處理，并進(jìn)行后續(xù)相關(guān)腦區(qū)免疫熒光染色。

2.4 灌流及腦組織固定

CD1-TH-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的病毒表達(dá) 5 周后，對小鼠進(jìn)行麻醉處理。待確認(rèn)進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后，將小鼠腹部朝上，四肢固定在灌流臺上，使用手術(shù)剪剪開小鼠腹腔和胸腔，在左心室心尖處插入灌注針頭，緊接著剪破右心房，以20 mL/min 的速度分別勻速灌注 20 mL 磷酸鹽緩沖液和濃度為 4% 的多聚甲醛溶液。完成灌注后，將腦組織剝出并浸泡在濃度為 4% 的多聚甲醛溶液中，固定 1 d 后換成濃度為 30% 的蔗糖溶液對其進(jìn)行脫水處理。最后，當(dāng)腦組織沉到蔗糖溶液底部時(一般為 1～3 d 后)，用冰凍包埋劑(Opti-mum Cutting Temperature，OCT；Sakura)對腦組織進(jìn)行包埋并放置于－20 ℃ 冰箱中備用。

2.5 切片及免疫熒光染色

將包埋并冷凍好的腦組織進(jìn)行冰凍切片(Leica CM1950 冰凍切片機，切片厚度為 30 μm)。切片完成后，將目標(biāo)腦區(qū)的腦片收集于預(yù)先添加了磷酸鹽緩沖液的 24 孔板中，隨后在切片上進(jìn)行 FBJ 骨肉瘤癌基因(cFBJ osteosarcoma oncogene，cFos)及酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase，TH)抗體的免疫熒光共染，檢驗小鼠藍(lán)斑及前庭神經(jīng)核在壓力應(yīng)激下可能激活的神經(jīng)元類型。其中，免疫熒光的染色過程盡可能避光進(jìn)行。首先，用磷酸鹽緩沖液將腦片漂洗 3 次(室溫，搖床速度為 40 r/min，10 min)，再將 0.3% 的磷酸鹽吐溫緩沖液(磷酸鹽緩沖液和 0.3% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100))與山羊血清按照體積比為 9∶1 配制封閉液，并在室溫下避光對腦片進(jìn)行封閉處理 1 h。然后，將腦片轉(zhuǎn)移到含有兩種一抗的孵育液中(Rabbit anti-c-Fos，一抗與磷酸鹽緩沖液體積比為 1∶500，品牌 CST，貨號 9F6；Chichen anti-TH，一抗與磷酸鹽緩沖液體積比為 1∶500，品牌 Abcam，貨號 ab76442)，4 ℃，搖床速度為 20 r/min，12 h，再用磷酸鹽緩沖液漂洗3 次(室溫，搖床速度為 40 r/min，10 min)。緊接著將腦片放入包含兩種二抗的孵育液中(Goat anti-rabbit 488，二抗與磷酸鹽緩沖液體積比為 1∶200，品牌Jackson，貨號 11 545003；Goat anti-Chichen 594，二抗與磷酸鹽緩沖液體積比為 1∶200，品牌 Abcam，貨號 ab150169)，室溫，搖床速度為 20 r/min，1 h。二抗孵育完成后，用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚溶液(4′,6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI)(DAPI 原液與磷酸鹽緩沖液按體積比 1∶5 000稀釋)對腦片進(jìn)行染核孵育(室溫，搖床速度為20 r/min，10 min)，隨后用磷酸鹽緩沖液將腦片漂洗 3 次(室溫，搖床速度為 40 r/min，10 min)，再將腦片貼于載玻片上，并用封片劑封片。最后，用玻片掃描儀(奧林巴斯 VS120)拍照并進(jìn)一步研究目標(biāo)腦區(qū)病毒表達(dá)情況或 cFos 激活情況。

3 實驗結(jié)果

3.1 順行腺相關(guān)病毒示蹤顯示前庭神經(jīng)核內(nèi)側(cè)核存在由藍(lán)斑投射過來的神經(jīng)末梢

鑒于藍(lán)斑與前庭神經(jīng)核在功能上的相關(guān)性，本研究利用嗜神經(jīng)病毒示蹤的方法來探究藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的可能神經(jīng)連接。利用腦立體定位注射技術(shù)在 CD1-TH-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠的藍(lán)斑注射 AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPREpA 病毒，從而特異性地感染藍(lán)斑的酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元。病毒表達(dá) 5 周后，對藍(lán)斑部位胞體及前庭神經(jīng)核部位神經(jīng)末梢的表達(dá)進(jìn)行檢驗。結(jié)果顯示，藍(lán)斑的 TH 陽性神經(jīng)元被病毒感染并在胞體表達(dá)(圖 1(a～b))，同時發(fā)現(xiàn)前庭神經(jīng)核具有來自藍(lán)斑的投射，這些神經(jīng)末梢主要集中于前庭神經(jīng)核沿第四腦室的邊緣(圖 1(c～f))。這一結(jié)果用腺相關(guān)病毒順行的特性證明了藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核投射的存在，并且這種投射應(yīng)該是 TH 神經(jīng)元的投射。

圖1 順行示蹤病毒顯示前庭神經(jīng)核具有從藍(lán)斑來的神經(jīng)投射Fig.1 The virus AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA showed that the vestibular nuclei has nerve fibers originated from the locus coeruleus

3.2 藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的投射為去甲腎上腺素能

為進(jìn)一步驗證藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核投射的性質(zhì)，在上述結(jié)果基礎(chǔ)上對神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色。其中，病毒感染表達(dá)的熒光為紅色熒光(mCherry)，本研究對 TH 抗體的染色采用綠色的二抗。結(jié)果顯示，AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA 感染的絕大部分藍(lán)斑神經(jīng)元與 TH 的免疫熒光染色信號有高度的共標(biāo)(圖 2)，表明該病毒的確特異性感染了藍(lán)斑的 TH 陽性神經(jīng)元。前庭神經(jīng)核腦區(qū)的免疫熒光染色顯示，從藍(lán)斑投射過來的神經(jīng)纖維(紅色熒光)部分也可與 TH 抗體染色(綠色熒光)共標(biāo)(圖 3)，這表明藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的投射至少部分是 TH 陽性的神經(jīng)纖維。

圖2 酪氨酸羥化酶抗體免疫熒光染色驗證藍(lán)斑腦區(qū)被感染神經(jīng)元類型Fig.2 Tyrosine hydroxylase antibody immunofluorescence staining verified that the locus coeruleus neurons infected were TH-positive

圖3 藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元感染病毒后到 VN 的神經(jīng)末梢進(jìn)行酪氨酸羥化酶抗體的免疫熒光染色顯示此神經(jīng)末梢表達(dá) TH 蛋白Fig.3 Tyrosine hydroxylase antibody immunofluorescence staining verified that the LC-VN projections revealed by AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA injection into the LC of CD1-TH-cre mice were TH positive

3.3 睡眠剝奪壓力模型引起藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元激活

有實驗表明，睡眠剝奪與線性振蕩對暈動病有加重的作用[28]，而間歇性短暫睡眠會導(dǎo)致藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元表現(xiàn)出持續(xù)的形態(tài)改變和細(xì)胞數(shù)量的減少[27]。因此，本實驗對野生型小鼠進(jìn)行了睡眠剝奪 1 d 的壓力處理，以研究在壓力范式下藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元激活及可能的前庭神經(jīng)核神經(jīng)元激活情況。實驗結(jié)果(圖 4)表明，與對照組相比，睡眠剝奪的壓力范式(壓力組)表現(xiàn)出更多的藍(lán)斑神經(jīng)元激活(圖 4(n)，P＜0.05)；cFos 與 TH 抗體共染結(jié)果顯示，絕大部分被激活的藍(lán)斑神經(jīng)元是 TH 陽性神經(jīng)元(圖 4(i～m))，然而該范式并沒有引起前庭神經(jīng)核神經(jīng)元的激活(圖 5)。

圖4 對照組和睡眠剝奪壓力組藍(lán)斑 cFos 與 TH 抗體免疫熒光共染結(jié)果Fig.4 The co-staining of cFos and TH immunofluorecence in the LC of the control and sleep-deprivation stress group

圖5 對照組和睡眠剝奪壓力組前庭神經(jīng)核 cFos 與 TH 抗體免疫熒光共染結(jié)果Fig.5 The co-staining of cFos and TH immunofluorecence in the VN of the control and sleep-deprivation stress group

4 討論與分析

前庭神經(jīng)核是保持平衡的關(guān)鍵核團(tuán)，其功能異常與暈動病、前庭偏頭痛、帕金森氏病等多種疾病狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)，壓力應(yīng)激往往會加重以上疾病的癥狀[7-8,13-15]。藍(lán)斑-去甲腎上腺素能系統(tǒng)在壓力應(yīng)激下激活，但該系統(tǒng)與前庭神經(jīng)核的神經(jīng)結(jié)構(gòu)連接及功能關(guān)聯(lián)仍不清楚，且目前大部分的研究集中在前庭神經(jīng)核到藍(lán)斑的投射上。本文實驗利用轉(zhuǎn)基因小鼠藍(lán)斑嗜神經(jīng)腺相關(guān)病毒立體定位注射的方法，研究藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的神經(jīng)投射并驗證其細(xì)胞類型為酪氨酸羥化酶陽性。進(jìn)一步給予小鼠睡眠剝奪的壓力范式，發(fā)現(xiàn)該壓力強烈激活了藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元，但前庭神經(jīng)核的神經(jīng)元未見明顯激活，提示文獻(xiàn)中提到的睡眠問題導(dǎo)致暈動病的神經(jīng)機制可能涉及到藍(lán)斑去甲腎上腺素激活元激活及其到前庭神經(jīng)核的神經(jīng)投射，而非源于直接激活前庭神經(jīng)核的神經(jīng)元。

藍(lán)斑作為腦內(nèi)去甲腎上腺素的主要來源，存在廣泛的下游神經(jīng)投射，除了藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的投射外，還發(fā)現(xiàn)了藍(lán)斑到其他下游核團(tuán)，如小腦、室旁丘腦核、海馬、下丘腦外側(cè)區(qū)、中央杏仁核和導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)等的投射，與文獻(xiàn)報道一致[18,29-30]。實際上，在 20 世紀(jì)末，Schuerger 和Balaban[29,31]將示蹤劑熒光金(10% Fluoro-Gold)注射到大鼠前庭神經(jīng)核，發(fā)現(xiàn)藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的投射關(guān)系。本文實驗結(jié)果與他們的研究結(jié)果一致：存在藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的直接投射。與前面Schuerger 和 Balaban 的研究相比，本實驗采用了嗜神經(jīng)病毒示蹤的辦法，在確保動物存活和執(zhí)行正常生理功能的前提下，研究藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的神經(jīng)投射關(guān)系。此外，本實驗采用的 Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)合 AAV-DIO 病毒系統(tǒng)，可以精準(zhǔn)地只感染藍(lán)斑的去甲腎上腺素能神經(jīng)元，具有細(xì)胞類型的特異性。Shi 等[32]利用熒光顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)(fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography，fMOST)神經(jīng)示蹤全腦成像技術(shù)細(xì)致地研究了前庭神經(jīng)核中谷氨酸能神經(jīng)元的輸入和輸出。結(jié)果顯示，前庭神經(jīng)核谷氨酸能神經(jīng)元可以直接投射到藍(lán)斑，而且前庭神經(jīng)核谷氨酸能神經(jīng)元也接收到來自藍(lán)斑的直接神經(jīng)投射。但是，該研究并沒有對投射到前庭神經(jīng)核谷氨酸能神經(jīng)元的上游藍(lán)斑神經(jīng)元的具體細(xì)胞類型進(jìn)行驗證。

為了進(jìn)一步驗證 Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)合 AAVDIO 病毒系統(tǒng)顯示的藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的細(xì)胞特異性神經(jīng)投射關(guān)系，本實驗對藍(lán)斑的胞體神經(jīng)元和前庭神經(jīng)核的神經(jīng)末梢進(jìn)行了酪氨酸羥化酶抗體的染色鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藍(lán)斑中病毒感染陽性的神經(jīng)元的確也能被酪氨酸羥化酶抗體識別，并且被感染的前庭神經(jīng)核神經(jīng)元末梢也能與酪氨酸羥化酶抗體染色陽性信號共標(biāo)。但并不是所有的藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的 mCherry 紅色熒光神經(jīng)纖維都能與酪氨酸羥化酶抗體染色陽性的綠色熒光信號共標(biāo)，其原因可能是在神經(jīng)末梢上的酪氨酸羥化酶蛋白表達(dá)水平并不高；鑒于抗體染色顯示蛋白表達(dá)的敏感性限制，可能存在藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核 mCherry 神經(jīng)末梢表達(dá)該蛋白但沒有共標(biāo)綠色熒光的情況。

已知壓力應(yīng)激、睡眠障礙等對前庭系統(tǒng)功能具有影響，但具體的機制尚不清楚。在本文工作的功能試驗中，一天的睡眠剝奪壓力并沒有引起前庭神經(jīng)核明顯的 cFos 激活，然而藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元的激活非常劇烈。提示該壓力更可能通過藍(lán)斑去甲腎上腺素能系統(tǒng)的激活及其投射到前庭神經(jīng)核的神經(jīng)末梢起作用，而不是通過直接激活前庭神經(jīng)核的神經(jīng)元起作用。本研究的局限之一在于壓力應(yīng)激范式不夠多樣化，只進(jìn)行了一天的睡眠剝奪壓力處理。故本研究結(jié)果并不能排除給予更高強度的壓力應(yīng)激后會引起前庭神經(jīng)核神經(jīng)元的激活，如采用 4 d 的睡眠剝奪、慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激、慢性社交壓力、母嬰分離應(yīng)激刺激等。本研究的局限之二是未能利用光遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)等技術(shù)對藍(lán)斑-前庭神經(jīng)核的去甲腎上腺素能神經(jīng)投射進(jìn)行功能操控來驗證該神經(jīng)投射的功能充分性和必要性。

藍(lán)斑去甲腎上腺素能系統(tǒng)的紊亂與多種疾病相關(guān)，藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的去甲腎上腺素能神經(jīng)環(huán)路的詳細(xì)解析將為多種壓力應(yīng)激、平衡問題相關(guān)的疾病提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步研究相應(yīng)的干預(yù)策略和治療靶點提供實驗室基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

前庭神經(jīng)核是保持平衡的關(guān)鍵核團(tuán)，其功能異常與暈動病、前庭偏頭痛、帕金森氏癥等多種疾病狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)，壓力應(yīng)激往往會加重以上疾病的癥狀并伴隨藍(lán)斑去甲腎上腺素能系統(tǒng)的激活。本研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)合病毒示蹤顯示從藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的去甲腎上腺素能神經(jīng)投射。藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元在睡眠剝奪壓力下被激活，提示藍(lán)斑到前庭神經(jīng)核的去甲腎上腺素能神經(jīng)環(huán)路在壓力應(yīng)激與前庭神經(jīng)核功能調(diào)控之間的重要作用。