劉亞銘 王 康 崔玉琳 陳 高 秦 松*

1(中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264003)

2(中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 101418)

3(中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071)

4(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所 濟(jì)南 250100)

5(山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南 250100)

1 引 言

類(lèi)胡蘿卜素(Carotenoids)是一類(lèi)廣泛存在于高等植物、真核微藻和藍(lán)藻光合膜的烯萜類(lèi)化合物[1]，通常是由 8 個(gè)類(lèi)異戊二烯單位組成的碳?xì)浠衔锛捌溲趸苌颷2-3]。在光合生物中，其作為捕光色素成分參與光合作用，并可以通過(guò)清除自由基和抗氧化來(lái)實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)[4-5]。研究表明，類(lèi)胡蘿卜素在人體健康方面也發(fā)揮著重要作用。其中，一些類(lèi)胡蘿卜素可作為人體內(nèi)維生素 A 的重要來(lái)源；而大部分的類(lèi)胡蘿卜素有很強(qiáng)的抗氧化活性[6]，能夠增強(qiáng)人和動(dòng)物的免疫力[2,7-8]，具有多種重要的保健功能和較大的醫(yī)用價(jià)值。例如，角黃質(zhì)具有抗氧化、抗癌、提高免疫力，以及保護(hù)皮膚和骨骼健康等作用[4]；金盞花黃質(zhì)作為蝦青素合成的中間產(chǎn)物，可以通過(guò)激活抗氧化防御對(duì)出血性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用，具有防止腦內(nèi)出血的潛力[9]。

藍(lán)藻，又稱(chēng)藍(lán)細(xì)菌，是一類(lèi)能夠進(jìn)行光合作用的原核生物[10]。集胞藻 PCC 6803 是研究代謝調(diào)控的模式藍(lán)藻，也是利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建細(xì)胞工廠的優(yōu)良底盤(pán)[11-12]。其既能自養(yǎng)，又能異養(yǎng)，并且遺傳背景清晰，是最早完成全基因組測(cè)序的藻類(lèi)，具有天然的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[13]。集胞藻 PCC 6803 中含有的內(nèi)源性 β-胡蘿卜素單酮醇酶能催化β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為海膽酮，但不能將海膽酮進(jìn)一步轉(zhuǎn)化；而內(nèi)源性 β-胡蘿卜素羥化酶(β-Carotene Hydroxylase，CRTR-B)[14-15]也只能催化 β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為玉米黃素。然而，在雨生紅球藻中，β-胡蘿卜素酮化酶(β-Carotene Ketolase，BKT)[14]不僅可以催化 β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為海膽酮，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為角黃質(zhì)，還可以催化金盞花黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為蝦青素；β-胡蘿卜素羥化酶則可以催化 β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為玉米黃素，并催化角黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為蝦青素。

為進(jìn)一步闡明bkt基因和crtR-B基因的功能及其作用機(jī)制，本文克隆了來(lái)自雨生紅球藻的 β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和 β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)，并在集胞藻 PCC 6803 中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)集胞藻中類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑的修飾。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明bkt基因和crtR-B基因的功能及其作用機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)，也為研究其他微型藻類(lèi)中的類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑提供參考。

2 材料與方法

2.1 集胞藻 PCC 6803 的培養(yǎng)

集胞藻 PCC 6803 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，編號(hào) FACHB-898。使用 BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)集胞藻 PCC 6803，培養(yǎng)溫度為(30±2)℃，光照強(qiáng)度為 50 μmol photon/(m2·s－1)，光/暗周期為 12 h/12 h。

2.2 同源重組載體的構(gòu)建

首先，使用植物基因組 DNA 提取試劑盒(大連寶生物，中國(guó))提取集胞藻 PCC 6803 的基因組DNA；然后，利用大腸桿菌 DH-5α(Invitrogen，中國(guó))進(jìn)行 DNA 克隆和質(zhì)粒構(gòu)建，并在 37 ℃、160 r/min 搖床中培養(yǎng)；最后，使用細(xì)菌質(zhì)粒DNA 快速提取試劑盒(上海生工，中國(guó))提取重組質(zhì)粒。根據(jù)集胞藻 PCC 6803 密碼子偏好性對(duì)來(lái)自雨生紅球藻的bkt基因(GenBank：AY603347.1)和crtR-B基因(GenBank：AF162276.1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的bkt基因和crtR-B基因由 GenScript 公司合成。p5S1285UD-bkt質(zhì)粒和pSKT1T2-crtR-B質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖 1。從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取已知的基因序列，用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，本研究中所用引物見(jiàn)表 1(均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

圖1 p5S1285UD-bkt 和 pSKT1T2-crtR-B 質(zhì)粒圖譜Fig.1 Plasmid maps of p5S1285UD-bkt and pSKT1T2-crtR-B

2.3 集胞藻 PCC 6803 的轉(zhuǎn)化和突變株的篩選

離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的集胞藻 PCC 6803 藻株，其在 730 nm 處的光密度(Optical Density，OD)值約為 0.6，使用新鮮的 BG11 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至OD730＝2.5，備用。將上述得到的質(zhì)粒通過(guò)自然轉(zhuǎn)化法[16]轉(zhuǎn)化至處理好的藻細(xì)胞中。在含有 5 μg/mL 慶大霉素和 25 μg/mL卡那霉素的 BG11 固體培養(yǎng)基上，對(duì)轉(zhuǎn)化后的集胞藻 PCC 6803 分別進(jìn)行篩選。同時(shí)，將轉(zhuǎn)化初始質(zhì)粒 p5S1285UD[17]和 pSKT1T2[16]的突變株設(shè)為對(duì)照組。

2.4 突變株的驗(yàn)證

對(duì)于突變株的 DNA 水平驗(yàn)證，提取集胞藻PCC 6803 野生型和突變株基因組 DNA，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)驗(yàn)證目的基因的轉(zhuǎn)入情況，引物見(jiàn)表 1。

具體地，先使用植物 RNA 提取試劑盒(Omega，中國(guó))提取集胞藻 PCC 6803 野生型和突變株的總 RNA；然后，通過(guò) cDNA 合成試劑盒(大連寶生物，中國(guó))將 mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；最后，以 cDNA 作為模板，分別用引物bkt-RT-F/bkt-RT-R 和crtR-B2-F/crtR-B2-R 檢驗(yàn)bkt基因和crtR-B基因 RNA 水平的表達(dá)。

2.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的集胞藻，調(diào)節(jié)初始接種濃度OD730值為 0.5，每 24 h 取樣 1 次，用普析Tu-1810 紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD730值，繪制生長(zhǎng)曲線。其中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)置 3 個(gè)平行。

2.6 色素分析

本文使用的類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Sigma(中國(guó))。參照 Baroli 等[18]的方法，用丙酮提取色素，并通過(guò) Thermo Fisher UltiMate-3000 液相色譜儀(配置 UV-可見(jiàn)檢測(cè)器)對(duì)色素進(jìn)行分離和鑒定。其中，色譜柱使用 C18 反相柱，Acclaim 120A(5 μm×4.6 mm×250 mm)。流動(dòng)相比例參數(shù)、流速以及梯度洗脫時(shí)間均參照文獻(xiàn)[18]的方法設(shè)定。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)表示為 3 次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用 SPSS 軟件進(jìn)行信度檢測(cè)。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 突變株的構(gòu)建和鑒定

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的表達(dá)載體 p5 S1285 UDbkt和 pSKT1T2-crtR-B如圖 1 所示。其中，p5S1285UD-bkt質(zhì)粒中含有 1 000 bp 上游同源臂(1285U，GenBank：NC_017277.1)和 1 000 bp下游同源臂(1285D)，并使用從 pFastBacI 質(zhì)粒(Invitrogen)克隆慶大霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因。在 pSKT1T2-crtR-B質(zhì)粒中，PpsbA2啟動(dòng)子和由引物 PpsbA2-F/PpsbA2-R 擴(kuò)增的psbA2開(kāi)放閱讀框作為上下游同源臂。另外，在 pSKT1T2-crtR-B質(zhì)粒中以卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化和抗生素篩選后，采用 PCR驗(yàn)證目的基因的轉(zhuǎn)入情況，分別檢測(cè)野生型和突變株基因組 DNA 中外源序列是否進(jìn)行同源重組。當(dāng)使用引物 1285U-F/1285D-R 對(duì)整個(gè)同源交換片段進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，在bkt-Gm突變株中擴(kuò)增出預(yù)期的 4.9 kb 條帶，而在對(duì)照組中僅擴(kuò)增出2.0 kb 條帶(圖 2(a))，表明bkt-Gm突變株中包含Gm基因和bkt基因的外源基因表達(dá)盒已經(jīng)整合到基因組 DNA 中。同樣，如圖 2(b)，當(dāng)用引物 PpsbA2-F/PpsbA2-R 對(duì)整個(gè)同源交換片段進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，在crtR-B-Kan突變株中擴(kuò)增出預(yù)期的 4.1 kb條帶，而在對(duì)照組中僅擴(kuò)增出 1.5 kb 條帶，這表明crtR-B-Kan突變株的基因組 DNA 中已經(jīng)整合了包含crtR-B基因和Kan基因的外源基因表達(dá)盒。同時(shí)，測(cè)序結(jié)果也表明，crtR-B基因和bkt基因已經(jīng)整合到集胞藻 PCC 6803 基因組DNA 中。

圖2 DNA 水平鑒定Fig.2 The identification of mutant in DNA level

為了進(jìn)一步驗(yàn)證bkt基因和crtR-B基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，從野生型和突變株中提取總 RNA。如圖 3 所示，在bkt-Gm突變株和crtR-B-Kan突變株中分別擴(kuò)增出代表bkt基因和crtR-B基因的大約 410 bp 和 258 bp 的條帶，而在對(duì)照組中沒(méi)有觀察到條帶，說(shuō)明整合到基因組中的bkt基因和crtR-B基因被轉(zhuǎn)錄。這表明，bkt基因和crtR-B基因完全轉(zhuǎn)入集胞藻 PCC 6803，且具有表達(dá)活性，bkt-Gm突變株和crtR-B-Kan突變株已構(gòu)建成功。

圖3 RNA 水平鑒定Fig.3 The identification of mutant in RNA level

3.2 正常培養(yǎng)條件下藻株的生長(zhǎng)情況

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)入bkt基因和crtR-B基因是否對(duì)藻株的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，本文檢測(cè)了野生型與突變株在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況。圖 4 結(jié)果顯示，野生型和突變株的生長(zhǎng)速率相似，表明轉(zhuǎn)入bkt基因和crtR-B基因?qū)宓纳L(zhǎng)基本沒(méi)有影響。

圖4 正常培養(yǎng)條件下野生型、bkt-Gm 突變株和crtR-B-Kan 突變株的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of wild strain,bkt-Gm mutants and crtR-B-Kan mutants under normal condition

3.3 野生型和突變株的色素差異

高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)檢測(cè)結(jié)果(圖 5)顯示，bkt-Gm突變株產(chǎn)生了角黃質(zhì)，其含量為(1.38±0.07)mg/g，且海膽酮含量下降為(7.72±0.29)mg/g、β-胡蘿卜素含量下降為(13.12±0.49)mg/g(表 2)；而crtR-B-Kan突變株中檢測(cè)出金盞花黃質(zhì)，其含量為(0.98±0.04)mg/g，且玉米黃素含量下降為(4.18±0.09)mg/g、β-胡蘿卜素含量下降為(12.80±0.14)mg/g(表 2)。

圖5 HPLC 檢測(cè)來(lái)自集胞藻 PCC 6803 野生型、bkt-Gm 突變株和 crtR-B-Kan 突變株的類(lèi)胡蘿卜素Fig.5 HPLC analysis of pigment production from the Synechocystis sp.PCC 6803 wild type,bkt-Gm mutants and crtR-B-Kan mutants

表2 色素含量Table 2 The content of pigment

4 討論

集胞藻 PCC 6803 中含有一種 β-胡蘿卜素單酮醇酶基因(GenBank：NC_000911)，其編碼的酶能從氧氣(O2)中轉(zhuǎn)移氧原子來(lái)氧化 C4 位的 β-胡蘿卜素[19]，β-胡蘿卜素單酮醇酶通常能將 β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為海膽酮[20]。β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)被認(rèn)為是一種與 β-胡蘿卜素單酮醇酶具有相同功能的酶，參與 β-胡蘿卜素合成蝦青素。雖然二者都是 β-胡蘿卜素酮化酶，但在催化機(jī)理上不同[21]。其中，BKT 是在 β-胡蘿卜素的 2 個(gè) β-紫羅蘭酮環(huán)中各插入 1 個(gè)酮基[22]，而 β-胡蘿卜素單酮醇酶是在 β-胡蘿卜素的 2 個(gè) β-紫羅蘭酮環(huán)之一插入 1 個(gè)酮基以合成海膽酮[21,23]。本文研究結(jié)果表明，來(lái)自雨生紅球藻的 BKT 可以在集胞藻中利用海膽酮進(jìn)一步合成角黃質(zhì)。

集胞藻 PCC 6803 中含有 β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR,GenBank:NP_440788.1)，負(fù)責(zé)將 1個(gè)羥基引入 β-胡蘿卜素的 β-紫羅蘭酮環(huán)[24]中。CRTR 能夠催化 β-胡蘿卜素形成玉米黃素，并在集胞藻 PCC 6803 中合成藍(lán)藻葉黃素。β-胡蘿卜素羥化酶(CRTR-B)是一種來(lái)自雨生紅球藻的蝦青素合成途徑中的關(guān)鍵酶，可將 2 個(gè)羥基引入 β-胡蘿卜素中[14]。在蝦青素合成途徑中，CRTR-B負(fù)責(zé)將 β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為 β-隱黃質(zhì)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為玉米黃素，最終將角黃素轉(zhuǎn)化為蝦青素。盡管 CRTR-B 和 CRTR 都被稱(chēng)為 β-胡蘿卜素羥化酶，但來(lái)自陸生植物和綠藻的 β-胡蘿卜素羥化酶由crtR-B基因編碼[25-26]，而藍(lán)藻 β-胡蘿卜素羥化酶由crtR基因編碼，且系統(tǒng)發(fā)育上與crtR-B無(wú)關(guān)[27]。本文研究結(jié)果顯示，來(lái)自雨生紅球藻的CRTR-B 可以在集胞藻中利用玉米黃素進(jìn)一步合成金盞花黃質(zhì)。

類(lèi)胡蘿卜素已被廣泛認(rèn)為是安全的天然抗氧化劑和抗癌劑。而不同的微藻產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的類(lèi)胡蘿卜素是由具有特定催化功能的類(lèi)胡蘿卜素合成酶決定。深入了解微藻中類(lèi)胡蘿卜素的生物合成機(jī)制既有利于促進(jìn)其在食品和制藥行業(yè)的生產(chǎn)和應(yīng)用，也為下一步在集胞藻中合成蝦青素，構(gòu)建性能優(yōu)良的藻株奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

通過(guò)在集胞藻 PCC 6803 中分別轉(zhuǎn)入來(lái)自雨生紅球藻的bkt基因和crtR-B基因，采用 HPLC檢測(cè)色素組成發(fā)現(xiàn)，外源基因的表達(dá)對(duì)集胞藻PCC 6803 類(lèi)胡蘿卜素的合成產(chǎn)生了影響。轉(zhuǎn)入bkt基因的細(xì)胞產(chǎn)生角黃質(zhì)的同時(shí)海膽酮含量下降，表明是外源的 β-胡蘿卜素酮化酶將海膽酮轉(zhuǎn)化為角黃質(zhì)；轉(zhuǎn)入crtR-B基因的細(xì)胞產(chǎn)生金盞花黃質(zhì)的同時(shí)玉米黃素含量下降，表明是外源的 β-胡蘿卜素羥化酶將玉米黃素轉(zhuǎn)化為金盞花黃質(zhì)。本文結(jié)果表明，分別來(lái)自雨生紅球藻和集胞藻 PCC 6803 的不同 β-胡蘿卜素酮化酶和 β-胡蘿卜素羥化酶具有不同的功能，僅依靠來(lái)自集胞藻PCC 6803 的 β-胡蘿卜素酮化酶和 β-胡蘿卜素羥化酶無(wú)法合成蝦青素。本實(shí)驗(yàn)初步揭示了集胞藻PCC 6803 中類(lèi)胡蘿卜素代謝機(jī)制，為通過(guò)基因工程手段在集胞藻 PCC 6803 細(xì)胞內(nèi)積累蝦青素奠定了基礎(chǔ)。