李雪潔 周年偉 孫敏敏 李 偉 汪詠蒔 謝惠琳 舒先紅

（1復旦大學附屬中山醫(yī)院心超室，2心內(nèi)科 上海 200032；3上海市影像醫(yī)學研究所 上海 200032；4上海市心血管病研究所 上海 200032）

FLNC編碼的細絲蛋白C（filamin C，F(xiàn)LNC）是一種廣泛存在于心肌及骨骼肌中的蛋白質，以同源二聚體的形式表達，主要通過與肌動蛋白交聯(lián)維持肌節(jié)的機械穩(wěn)定性。最初，F(xiàn)LNC基因突變在肌原纖維肌病中被發(fā)現(xiàn)，近年來在肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）、擴張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）、限制型心肌病（restrictive cardiomyopathy，RCM）和致心律失常性心肌?。╝rrhythmogenic ventricular cardiomyopathy，ACM）中也被陸續(xù)報道。隨著基因篩查在臨床中的應用，F(xiàn)LNC已經(jīng)成為遺傳性心臟病的常見致病基因之一，在HCM 和RCM 患者中發(fā)現(xiàn)了許多FLNC的錯義突變，DCM 及ACM 患者中發(fā)現(xiàn)的則多為截斷突變，這表明不同類型的FLNC突變可能存在不同的致病機制。然而中國漢族人群心肌病患者攜帶FLNC突變的變異譜仍不明確，其基因型-表型的關聯(lián)性也值得進一步探究和討論。

資料和方法

入組人群2018 年至2020 年就診于復旦大學附屬中山醫(yī)院的150 名無血緣關系的漢族HCM 患者和50 名DCM 患者被納入研究。成年人HCM 的臨床診斷標準與以往文獻一致：一個或多個左室心肌節(jié)段的最大室壁厚度≥15 mm，或有明確家族史者最大室壁厚度≥13 mm（排除后負荷增加），通常不伴有左室擴大；家族性HCM 定義為在同一家系中有兩名以上的HCM 患者。DCM 的臨床診斷標準為具有心室擴大和心肌收縮功能降低的客觀證據(jù)：左室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）>5.0 cm（女性）和 LVEDd>5.5 cm（男性）（或>年齡和體表面積預測值的117%，即預測值的2 倍SD+5%）；左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）<45% 和左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）<25%，除外冠心病、高血壓病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、系統(tǒng)性疾病等；家族性DCM 定義為同一家系中有2 名或2 名以上的DCM 患者。收集患者的臨床信息，包括發(fā)病年齡、確診年齡、性別、癥狀、是否植入起搏器，并常規(guī)進行心電圖（electrocardiogram，ECG）和 經(jīng) 胸 超 聲 心 動 圖（transthoracic echocardiography，TTE）檢查。該實驗方案經(jīng)過復旦大學附屬中山醫(yī)院人類倫理委員會批準［B2016-016（2）R］，所有納入本研究的患者均已簽署知情同意書。

全外顯子組測序及變異解釋提取入組患者的外周血基因組DNA，在HiSeq XTEN 測序平臺（美國Illumina 公司）上進行全外顯子組測序。具體測序方法詳見本課題之前的研究［1-2］。測序后使用GATK（Genome Analysis Tool kit）進行變異檢測及初步分析，其中使用到多種人類基因突變和疾病相關數(shù)據(jù)庫，包括OMIM、1000G 和dbsnp 等。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的序列變異解釋標準和指南［3］，變異的致病性分為5 級：致病的（pathogenic，P），可能致病的（likely pathogenic，LP），意義不明確的（variant of uncertain significance，VUS），可能良性的（likely benign，LB）和良性的（benign，B）。一般情況下FLNC截斷變異被歸類為致病的（P）；除非有來自共分離或功能性實驗的額外證據(jù)，錯義變體被歸類為意義不明確的（VUS）。使 用 Polyphen-2、SIFT、PROVEAN 和 Mutation Taster 預測錯義變異，使用PROVEAN 和Mutation Taster 預測無義變異、插入和缺失（Insertion and Deletion，InDel），篩選出被解讀為致病的（P）和可能致病的（LP）變異，進行Sanger測序驗證及臨床研究。

致病性預測變異篩選及驗證流程見圖1。滿足下列條件的變異認為是可能致病的（P）：（1）在dbSNP 等人群數(shù)據(jù)庫中未報道；（2）變異位于進化上高度保守位點；（3）在人類基因突變數(shù)據(jù)庫中已有記錄的心肌病及離子通道病相關基因上的特殊變異類型，如移碼變異、終止獲得/缺失變異、剪接位點變異；（4）在家系中該變異與疾病表型共分離；如果家系資料不適用于共分離，則致病性判斷通過預測軟件判斷均為有害或可能有害的。

圖1 患者全外顯子測序及基因變異篩選流程圖Fig 1 Flow chart of whole exome sequencing and variants screening

結 果

本研究共發(fā)現(xiàn)6 個FLNC變異（編號為1~6），均未見報道，包括HCM 患者的3 個錯義變異，DCM 患者的1 個無義變異（截斷變異）和1 個InDel變異，RCM 患者的 1 個錯義變異，其中 1 例 DCM 為家族性，其余均為散發(fā)性病例。6 名患者均為男性，先證者及攜帶相同變異的家屬詳細臨床資料見表1，各變異的位點、類型、致病性預測等數(shù)據(jù)見表2 及圖 2。

表1 攜帶FLNC 變異的心肌病患者的臨床信息Tab 1 Clinical information of cardiomyopathy patients with FLNC variation

表2 患者攜帶的FLNC 變異信息Tab 2 Information of the FLNC variants detected in this study

1 號 RCM 患者，男性，44 歲，20 年前情緒激動后暈厥，在當?shù)蒯t(yī)院診斷為心肌肥厚，但未進一步隨訪和診療，直至4 年前頻繁出現(xiàn)心悸、活動后氣促，呈進行性加重，平地行走50 m 以上不能耐受，遂至當?shù)蒯t(yī)院檢查，ECG 示心房撲動和心房顫動伴快速心室率。2017 年12 月患者就診于我院，TTE 示：左室壁厚度13~22 mm，左室及右室收縮活動減弱，LVEF49%，雙房明顯增大伴輕度二尖瓣及三尖瓣反流；診斷為非梗阻性HCM，予抗凝、控制心室率等治療，癥狀有所緩解。1 年前因頻發(fā)心悸再次就診，2019 年 7 月 ECG 示心房撲 動，2：1 房室傳導；TTE 示：左右室壁增厚伴左右室壁整體收縮活動減弱（LVEF 50%），雙房增大伴輕度二尖瓣及三尖瓣反流；心臟MRI 示：符合限制性心肌病改變，心肌淀粉樣變待排；進一步行免疫固定電泳，結果呈陰性，最終確診為RCM。

2 號DCM 先證者攜帶FLNC的截斷變異及MYBPC3的錯義變異（測序峰圖及臨床資料見圖2），因患者母親沒有出現(xiàn)心肌病相關表型，未進行基因檢測，無法證實是否為FLNC的新發(fā)變異；MYBPC3錯義變異為罕見變異（GnomAD 中頻率為0.000016），預測為可能致病或有害的。15 年前出現(xiàn)勞累后胸悶，診斷為DCM，予卡維地洛、培哚普利等藥物治療，病情平穩(wěn)，2011 年5 月隨訪TTE示：左室顯著增大，左室心尖部見豐富海綿狀心肌成蜂窩狀伴左室壁整體收縮活動減弱，LVEF33%，繼續(xù)藥物治療，2012 年至2017 年多次隨訪TTE，LVEF 波動于30%~47%，ECG 提示Ⅱ度二型房室傳導阻滯，2017 年11 月因上呼吸道感染后出現(xiàn)急性左心衰伴呼吸性代謝性堿中毒，經(jīng)過抗感染、強心、利尿等治療，病情仍進一步惡化，2018 年1 月因心衰、肝性腦病死亡。其父親攜帶了相同的MYBPC3變異，11 年前因反復胸悶氣促診斷為DCM，Ⅱ度二型房室傳導阻滯（最長R-R 間期3.2 s）并行起搏器植入術。2012 年TTE 示：左房室擴大伴左室整體收縮活動減弱，LVEF31%，右房增大，中度三尖瓣反流；后多次隨訪TTE 心功能無明顯惡化，病情平穩(wěn)。

圖2 2 號DCM 患者及其父親的家系圖、測序峰圖及臨床資料Fig 2 The family tree，chromatogram and clinical data of DCM 2 and his father

5 號DCM 患者20年前體檢時發(fā)現(xiàn)二葉式主動脈瓣，18 年前出現(xiàn)活動后胸悶，于當?shù)卦\斷為陣發(fā)性房顫，左房增大，未系統(tǒng)治療。10 年前胸悶癥狀明顯加重，就診于我院，診斷為DCM。2010 年7 月，TTE示：先天性二葉縱裂式主動脈瓣畸形，輕度主動脈瓣反流，左室增大伴左室壁收縮活動減弱，LVEF35%，雙房增大伴輕度二尖瓣及中度三尖瓣反流；ECG 示：持續(xù)性房顫；于我院行 CRT-D 術。2018 年 3 月，隨訪心超示：CRT 術后雙房及左室擴大，左右室整體收縮活動減弱，LVEF28%，病情平穩(wěn)。

剩余3 例HCM 患者發(fā)病年齡分別為32、62 和25歲，室間隔和左室最大厚度分別為17、14、14 mm 和22、17、19 mm，3 名患者均表現(xiàn)出典型的勞力性呼吸困難和胸痛，就醫(yī)后診斷為HCM，3 人均無左室流出道梗阻，LVEF 正常。予美托洛爾治療，病情均穩(wěn)定。

討 論

Z 盤對于心臟的重要性眾所周知，其維持著心臟正常的機械活動，也參與多種生化途徑相關信號的接收和傳輸，F(xiàn)LNC 通過與多個Z 盤蛋白相互作用，可以承受肌節(jié)上的強收縮力［4］。FLNC 蛋白由3個結構域組成（圖3），位于氨基端的肌動蛋白結合結構域由2 個鈣調(diào)蛋白同源結構域組成，連接24 個重復串聯(lián)的免疫球蛋白樣結構域，免疫球蛋白樣結構域又由ROD1 和ROD2 兩個鉸鏈區(qū)及羧基端的二聚化結構域組成，F(xiàn)LNC 蛋白形成二聚體后才能與肌動蛋白結合。FLNC 蛋白不同結構域及不同類型的致病變異會導致不同的臨床表型。ROD2 域是絲蛋白C 與Z 盤蛋白之間相互作用的重要區(qū)域，此結構域的錯義突變會通過顯性負性作用產(chǎn)生異常的蛋白聚體（包含無法正常二聚的FLNC 和一些Z 盤相關蛋白），蛋白聚體在細胞質中積累導致肌節(jié)的排列及功能紊亂，產(chǎn)生 HCM 和 RCM［5-6］；位于肌動蛋白結合域的錯義突變會產(chǎn)生毒性的功能獲得，增強肌動蛋白結合活性導致肌??；而整個基因上的截斷突變與DCM 和ACM 有密切關聯(lián)，其通過無義介導的mRNA 降解機制產(chǎn)生基因單倍體不足，導致Z盤增厚紊亂，細胞間黏附減弱，影響橫紋肌的機械傳導［7-11］。攜帶FLNC錯義突變的骨骼肌病患者有一小部分存在心臟表型［12］，而FLNC相關心肌病患者罕有骨骼肌受累［7］。本研究中所有患者均無骨骼肌受累的表型，為什么FLNC錯義突變相關HCM、RCM 患者骨骼肌中無蛋白聚體，現(xiàn)在還難以解釋。修飾基因對FLNC表現(xiàn)度的影響、表觀遺傳學因素等可能共同作用于FLNC突變表型的復雜性，如果能夠發(fā)現(xiàn)相同突變激活的不同通路，對于尋找潛在的治療靶點可能存在重要的意義。

圖3 FLNC 的結構域及本研究發(fā)現(xiàn)的變異分布Fig 3 Structure domains and variations distribution of FLNC in our research

以往研究證明FLNC變異在HCM 患者中較常見，其與肌節(jié)蛋白突變導致的HCM 在臨床表型及預后方面沒有明顯差異［13］，本研究中 3 個 HCM 患者攜帶的FLNC錯義變異預測為可能致病，但是臨床意義未知，因此FLNC變異對于HCM 患者的表型影響可能需要謹慎解釋。在以往報道的病例中，F(xiàn)LNC相關DCM 的惡性程度更高，表現(xiàn)出與心室擴張程度不符的室性心律失常、心源性猝死高風險等特點［14］。本研究中 2 例 DCM 患者表現(xiàn)為發(fā)病年齡早，心功能惡化速度快，未觀察到惡性室性心律失常；對于多種心肌病、多個基因突變或復合突變的攜帶者終末期進展、心律失常和預后不良的風險明顯增加［15-17］，2 號 DCM 患者同時攜帶雙基因雜合變異，且均預測為可能致病的變異，與僅攜帶單基因變異的患者父親相比，臨床表現(xiàn)為發(fā)病年齡早，心功能惡化速度快伴隨傳導系統(tǒng)受累，這也符合之前的研究結果。有不同的研究者在HCM 及RCM患者中發(fā)現(xiàn)了相同的錯義突變（p.Ser1624Leu），提出攜帶該突變的家系可能存在HCM 和RCM 混合的表型［12，18］；本研究中，RCM 患者在發(fā)病初期僅表現(xiàn)為心肌肥厚，早期診斷為HCM，隨著病程進展出現(xiàn)雙房擴大，舒張功能明顯受限，最終確診為RCM，3 號HCM 患者與RCM 患者攜帶的變異堿基位點相鄰，導致相同的氨基酸替換，隨著年齡增加是否會進展成為RCM 尚不明確，我們將對此患者進行定期隨訪。

本研究對200 名漢族不同亞型心肌病患者進行全外顯子組測序，討論了在200 例漢族心肌病患者中FLNC基因的變異特點，擴大了心肌病中FLNC基因的變異譜，并進一步探討了在不同心肌病中FLNC變異的基因型和表型相關性。我們觀察到變異類型對于臨床特點有決定性作用，錯義突變干擾了蛋白質的二聚和折疊會導致HCM、RCM，截斷突變會通過單倍體不足導致細胞間黏附減弱，產(chǎn)生發(fā)病年齡早、進展快速的DCM。本研究不足之處在于作為單中心研究納入的人數(shù)較少，且未納入ACM 患者，這種心肌病中FLNC的突變譜及機制需要進一步的挖掘，另外本研究發(fā)現(xiàn)的變異需要在更大樣本的心肌病患者中進行對比和驗證，同時獲得更多功能驗證實驗的證據(jù)，以進一步確定其致病性。

作者貢獻聲明李雪潔 數(shù)據(jù)采集，論文撰寫。周年偉，孫敏敏，李偉，汪詠蒔，謝惠琳 數(shù)據(jù)采集。舒先紅 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。