李東東，劉偉偉，周子正，王傳旭，吳燕升，郭亞芳，高建東

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)腎病研究所，上海中醫(yī)藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院，上海 200134；3.上海市浦東醫(yī)院，上海 201399

尿酸引起的腎損傷包括急性尿酸鹽腎病、慢性尿酸鹽腎病和尿酸腎結(jié)石[1]，尿酸腎損傷主要由尿酸和/或尿酸鹽結(jié)晶在腎臟沉積而引起的氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮功能障礙等所致[2]。高尿酸血癥與多種腎臟病相關(guān)，也是導致慢性腎臟病進展的重要因素[3]。尿酸作為損傷相關(guān)分子模式的一種，可被固有免疫系統(tǒng)的Toll 樣受體（TLR）識別。TLR4 是細胞膜上一種模式識別受體，激活后可啟動下游核因子-κB（NF-κB）反轉(zhuǎn)錄，從而激活炎癥信號通路，通過上調(diào)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子水平，引起炎癥反應(yīng)[4]。研究顯示，TLR4/NF-κB 參與尿酸引起的腎臟損傷[5-6]。尿酸性腎?。║AN）病機為痰濕瘀血互結(jié)，與腎小管間質(zhì)炎癥相關(guān)[7-8]。降尿酸方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院臨床驗方，具有化痰祛濕散結(jié)之效。研究表明，其可降低UAN 患者血尿酸（SUA），改善腎功能[9]。本研究制備UAN大鼠模型，從TLR4/NF-κB 信號通路觀察降尿酸方對UAN 大鼠腎功能和尿酸鹽結(jié)晶的影響，揭示其機制。

1 實驗材料

1.1 藥物及制備

降尿酸方（酒大黃10 g，粉萆薢10 g，炒王不留行10 g，威靈仙10 g，炒車前子15 g，炒芥子10 g，山楂10 g），飲片由上海康橋中藥飲片有限公司提供，加水煎煮2 次，合并藥液，濃縮至含原藥材1.6 g/mL。別嘌醇緩釋膠囊，黑龍江澳利達奈德制藥有限公司，批號18030901，250 mg/粒，配制成2.5 mg/mL 溶液。

1.2 動物

SPF 級雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量（190±20）g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證號SYXK（滬）2014-0006，倫理號PZSHUTCM190315029。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度25 ℃，相對濕度45%，光/暗12 h 交替，自由攝食飲水。

1.3 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀（山東中科泰斗有限公司，批號080601），腺嘌呤（印度BioBharati Life Science 公司，批號EB27BA0015），蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0011），PVDF 膜（美國Milipore，貨號R4CA33126），兔抗大鼠TLR4 一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號A5258），兔抗大鼠NF-κB p65 一抗（美國CST 公司，貨號8242），兔抗大鼠TNF-α 一抗（英國Abcam 公司，貨號ab6671），β-actin 小鼠單克隆抗體（美國Proteintech公司，貨號66009），HRP 標記山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號A0216），山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號A0208），大鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號EK382/3-02），大鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號EK306/3-01）。自動組織脫水機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-TS3A），生物組織包埋機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-BM），攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-P），烘片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-H），透射電子顯微鏡（德國FEI 公司，Tecna G2 Bio TWIN），電泳儀、電源儀、垂直式蛋白電泳槽、濕轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組、模型組、別嘌醇組和降尿酸方組，每組8 只。參考文獻[10]方法造模，實驗開始第1 日，除正常組外，其余各組大鼠上午給予氧嗪酸鉀（1.5 g/kg）和腺嘌呤（0.1 g/kg）混合液灌胃，灌胃體積10 mL/kg，正常組給予等體積滅菌蒸餾水。造模藥應(yīng)用至少4 h 后，降尿酸方組和別嘌醇組分別按16 g/kg、25 mg/kg 劑量給予相應(yīng)藥液（相當于60 kg 成人臨床用藥劑量6 倍）灌胃，給藥體積10 mL/kg，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。造模與給藥同時進行，連續(xù)4 周。

2.2 樣本收集

給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離右腎，置于-80 ℃冰箱保存。另在冰上迅速取左腎，切取3 塊1 mm×1 mm×1 mm 大小腎皮質(zhì)組織，放入2.5%戊二醛固定液中，4 ℃避光保存，樣品送至上海中醫(yī)藥大學電鏡室觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。SUA、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）和24 h 尿蛋白（UTP）送至上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科檢測。

2.3 血清腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-6 含量檢測

嚴格按ELISA 試劑盒說明書進行操作，于酶標儀波長450 nm 處測定各孔OD 值，計算血清TNF-α、IL-6 含量。

2.4 病理觀察

冰上取腎組織，90%乙醇固定，室溫搖床放置24 h；梯度乙醇脫水；石蠟包埋，切片（4 μm），60 ℃烤片1 h。使用前將切片脫蠟至水，HE、Masson 和六胺銀染色，中性樹膠封片，鏡下觀察腎組織病理變化和尿酸鹽結(jié)晶沉積情況，電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。

2.5 免疫組化檢測

取腎組織切片，37 ℃烤片1 h，梯度乙醇脫水，微波修復，10%BSA 封閉1 h，加TNF-α 一抗（1∶50）、4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記二抗，室溫孵育1 h，DAB 顯色，中性樹膠封片，計算TNF-α 陽性表達的平均光密度。

2.6 Western blot 檢測

取20 mg 大鼠腎組織，加入200 μL RIPA 裂解液，勻漿機充分研磨，BCA 法測定蛋白濃度，95 ℃金屬浴10 min；取10 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳；蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過夜；PBST 洗滌3 次，滴加HRP 標記二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h；PBST 洗滌3 次，ECL 化學發(fā)光液孵育30 s，全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，計算目的蛋白條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較用方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊時用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 降尿酸方對模型大鼠血尿酸、血肌酐、血尿素氮和24 h 尿蛋白的影響

與正常組比較，模型組大鼠SUA、SCr、BUN 和24 h UTP 水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠SUA、BUN 和24 h UTP 水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠SUA、SCr、BUN、24 h UTP 水平比較（）

表1 各組大鼠SUA、SCr、BUN、24 h UTP 水平比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

4.2 降尿酸方對模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-6 含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠血清TNF-α、IL-6 含量明顯減少（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 含量比較（，pg/mL）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 含量比較（，pg/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

4.3 降尿酸方對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

HE、Masson 染色和透射電鏡觀察顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎小管管壁變薄，管腔擴張，局灶性炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化；腎小管上皮細胞線粒體數(shù)目減少，形態(tài)腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，有空泡形成，線粒體嵴排列紊亂或消失。與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織損傷有所改善，線粒體形態(tài)恢復正常，結(jié)構(gòu)清晰。見圖1～圖3。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE 染色，×200）

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson 染色，×200）

圖3 各組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)

六胺銀染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織有大量尿酸鹽結(jié)晶沉積（P＜0.01），尤其是腎小管區(qū)域；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織尿酸鹽結(jié)晶明顯減少（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織尿酸鹽結(jié)晶比較（六胺銀染色，，每組8 只）

4.4 降尿酸方對模型大鼠腎組織Toll 樣受體4、核因子-κB p65、腫瘤壞死因子-α 蛋白表達的影響

模型組較正常組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表達升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，降尿酸方組和別嘌醇組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖5、表3。TNF-α 免疫組化結(jié)果與Western blot 一致。見圖6。

表3 各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表達比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

圖5 各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白免疫印跡圖

圖6 各組大鼠腎組織TNF-α 陽性表達（免疫組化染色，，每組8 只）

5 討論

UAN 是可溶性尿酸鹽或尿酸鹽結(jié)晶沉積導致的腎臟損傷性疾病，目前治療以抑制尿酸生成、促進尿酸排泄和尿酸鹽結(jié)晶溶解為主。別嘌醇可抑制肝臟黃嘌呤氧化酶活性，減少尿酸生成，減輕腎臟炎癥和病理損傷，改善腎功能。本實驗結(jié)果顯示，降尿酸方可降低大鼠SUA、SCr、BUN、24 h UTP、TNF-α 和IL-6水平，改善腎功能。HE、Masson 染色和透射電鏡觀察表明，降尿酸方可減輕UAN 大鼠腎臟病理損傷，減輕腎間質(zhì)纖維化，保護腎小管上皮細胞。腎臟尿酸鹽結(jié)晶阻塞腎小管是急性尿酸腎損傷的主要原因[11]。本實驗中偏振光顯微鏡下可見UAN 大鼠腎臟有大量尿酸鹽結(jié)晶沉積，主要聚集在腎小管，別嘌醇和降尿酸方治療后，尿酸鹽結(jié)晶沉積相對減少，其中別嘌醇療效更為顯著。

尿酸作為危險相關(guān)分子模式的一種，可激活TLR4/NF-κB 信號通路，引起炎癥反應(yīng)。本實驗中，經(jīng)降尿酸方治療后，大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65、TNF-α 蛋白表達降低，表明降尿酸方可抑制TLR4/NF-κB 信號通路激活，降低TNF-α 表達，減輕腎臟炎癥。Yang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，五苓散可抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路，減輕尿酸引起的炎癥損傷。單佳鈴等[13]研究表明，短穗兔耳草提取物對尿酸鈉誘導的急性痛風性關(guān)節(jié)炎大鼠有一定的保護作用，其機制可能與TLR/MyD88/NF-κB 信號通路相關(guān)。據(jù)此我們推測，降尿酸方減輕腎臟炎癥可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路、降低TNF-α 表達相關(guān)。

中醫(yī)認為，UAN 形成多為先天稟賦不足，氣血運行不暢，停滯為瘀，聚而生痰，痰瘀互結(jié)，邪傷于腎；后天多食肥甘厚膩，或年過不惑，臟氣衰退，傷及臟腑，久必及腎所致。有學者認為，痰瘀互結(jié)是炎癥發(fā)生的實質(zhì)[14-16]。降尿酸方以炒王不留行祛痰通絡(luò)，炒車前子利水祛痰，炒芥子化痰散結(jié)，配山楂活血化瘀以止痛，粉萆薢、威靈仙可祛風勝濕、通絡(luò)止痛，酒大黃通二便直達下焦，深入血分，無堅不破，蕩滌積垢，諸藥合用，以達活血通絡(luò)、化痰降濁之功。綜上，降尿酸方可改善UAN 大鼠腎功能，減少尿酸鹽結(jié)晶沉積，減輕腎臟損傷，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路相關(guān)，其具體機制有待進一步研究。