黃燕，鄒天駿，羅雪菲，鐘振國，蘭太進

1.廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；3.廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心，廣西 南寧 530200

中藥在腫瘤的治療和預防中發(fā)揮著重要作用，具有多靶點和低毒性的特點[1-2]。余甘子Phyllanthus emblicaL.是大戟科Euphorbiaceae 葉下珠屬Phyllanthus落葉小喬木或灌木，在我國分布廣泛，資源豐富。全世界約有17 個國家的傳統(tǒng)藥物體系中使用了余甘子，我國約有16 個民族使用該藥[3]，其被2015 年版《中華人民共和國藥典》收載，以果實入藥[4]。在民間，余甘子常用于治療膽道疾病、支氣管炎、糖尿病等，也以根和葉入藥[5]。研究表明，余甘子葉具有廣泛的藥理活性[6]。目前認為黃酮類是余甘子葉的主要活性成分，并已鑒定出多種黃酮類化合物[7]。余甘子葉總黃酮（total flavonoids fromPhyllanthus emblicaleaves，TFPL）可抑制多種腫瘤的增殖，誘導細胞周期阻滯和凋亡[8-9]，但其調控機制和活性成分尚不甚清楚。本研究采用網絡藥理學方法，系統(tǒng)探究TFPL抗結直腸癌的分子機制及效應物質，為后續(xù)研究提供參考。

1 儀器、試藥與細胞

Impact Ⅱ型超高分辨四級桿飛行時間質譜儀，美國Bruker Daltonic；Waters 2695-2489 高效液相色譜儀，美國Waters；SynergyTMH1 型多功能微孔檢測儀，美國BioTek Instruments；3131 型二氧化碳培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技（中國）；STR16 型臺式冷凍離心機，美國Thermo；BSA224S 型分析天平，北京賽多利斯；Omni-G 型獨立超純水系統(tǒng)，廈門銳思捷；SCQ-6201型超聲波清洗儀，上海聲彥；UV-2550 型紫外可見分光光度計，日本島津；RE-5203 型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮；YRDC-0515 型低溫恒溫槽，上海亞榮；DHG-9203A 型電熱恒溫干燥箱，上海齊欣；HWS-24型水浴鍋，上海一恒。

余甘子葉采自廣西邕寧縣，經廣西中醫(yī)藥大學劉壽養(yǎng)教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥葉。1640 不完全培養(yǎng)基，江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號KG 038784；胎牛血清，浙江天杭科技股份有限公司，批號18 070503；MTS，江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號20 190304；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號20 161212；甲醇（分析純），成都科隆化學品有限公司，批號2018 030801；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 178512；DMSO，美國SIGMA-ALDRICH 公司，批號SHBG3288V；水為超純水，其他試劑均為分析純。

人結直腸腺癌細胞COLO 320DM、DLD-1 均購自中國科學院細胞庫，正常結直腸細胞NCM460 購自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 余甘子葉總黃酮制備

2.1.1 粗提取

取余甘子葉適量，粉碎成粗粉，加95%乙醇浸泡48 h 后進行滲漉，收集滲漉液；藥渣干燥，加50%乙醇浸泡48 h，加同濃度乙醇進行滲漉，收集滲漉液。合并2 次滲漉液，減壓濃縮，回收乙醇，得到濃縮液[10]。

2.1.2 純化

將D101 大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，使其充分膨脹，用蒸餾水洗至無漂浮物，濕法裝柱，沉淀24 h，濃縮液經溫水溶解后上柱，吸附2 h，用蒸餾水洗脫，至洗脫液澄清透明，再依次用30%、50%、70%乙醇進行洗脫，洗脫液顏色變淺后，換梯度洗脫，洗脫液與鹽酸-鎂粉呈陽性反應后開始收集洗脫液。將收集的各梯度洗脫液混合，減壓濃縮。用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層。減壓濃縮，干燥處理成粉末，即得TFPL[10]。

2.2 細胞增殖實驗

2.2.1 細胞種板

取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，得到單細胞懸液，細胞計數(shù)后調整至所需細胞量，置50 mL 離心管，加入培養(yǎng)基，定容至所需細胞懸液體積。吸取細胞懸液加入96 孔板，每孔100 μL，靜置30 min 后移至細胞培養(yǎng)箱孵育。

2.2.2 藥液配制

稱取TFPL 適量，加入DMSO，超聲溶解，制成0.05 g/mL 貯備液。吸取一定量貯備液，加入培養(yǎng)基，配成一定濃度藥物母液，350 W、25 kHz 超聲1 h。取母液，0.22 μm 針孔濾頭過濾2 次。等度稀釋法配制各濃度藥液。

吸取一定量DMSO，加入培養(yǎng)基，制成不同濃度（0.1%、0.2%、0.5%）DMSO 對照藥液，0.22 μm 針孔濾頭過濾1 次。

2.2.3 分組與給藥

分為7 個藥物濃度組（22.5、45、62.5、90、125、180、250 μg/mL）及空白對照組、DMSO 對照組。每組4 個復孔，每個給藥組另設2 個調零孔。種板第3日，吸出96 孔板中細胞培養(yǎng)液，加入100 μL 相應藥液，于細胞培養(yǎng)箱孵育。

2.2.4 指標檢測

給藥24、48、72 h，每孔加入10 μL MTS，孵育2 h，于波長490 nm 處檢測各孔光密度（OD），計算相對細胞活力（OD實驗組÷OD對照組×100%）。采用Excel2013 計算IC50。

2.3 余甘子葉總黃酮成分分析

采用液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）。

色譜條件：采用Agilent C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.5%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10%B；10～10.01 min，10%～12%B；10.01～20 min，12%～13% B；20～30 min，13%B；30～60 min，13%～21%B），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），負離子模式，毛細管電壓3 500 V，霧化氣壓力2 bar，干燥氣流速8.0 L/min，干燥氣溫度200 ℃；掃描模式為全掃描和auto ms/ms 掃描，掃描范圍（m/z）50～1 300。

結合一級質譜和二級質譜碎片離子信息，依據(jù)文獻檢索結果，通過與Scifinder、Massbank、Chemspider數(shù)據(jù)庫進行峰匹配檢索，初步鑒定得到TFPL 化合物成分信息。

2.4 網絡藥理學分析

2.4.1 余甘子葉總黃酮成分-靶點關系網絡構建

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取TFPL 化學成分的Smile 數(shù)據(jù)，輸入ChemMapper 數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/chemmapper），獲得各成分相關靶點，通過Cytoscape3.7.1 軟件構建TFPL 成分-靶點關系網絡。

2.4.2 結直腸癌相關靶點收集

以“Colorectal Cancer”為關鍵詞檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/），得到結直腸癌相關靶點，通過Cytoscape3.7.1 軟件構建結直腸癌靶點網絡。

2.4.3 共有靶點篩選

比對TFPL 相關靶點與結直腸癌相關靶點，二者共有靶點即為TFPL 抗結直腸癌的潛在靶點。

2.5 分子對接

采用Sybyl X 2.0 軟件評價關鍵靶點受體與化合物配體之間的結合能力。首先在PubChem 數(shù)據(jù)庫中搜索得到化合物sdf 格式的結構，使用Open Babel GUI 軟件將其轉化為mol2 格式，導入Sybyl X 2.0 軟件，進行能量優(yōu)化并保存為mol2 格式文件。然后通過Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）搜索蛋白晶體結構并下載PDB 格式文件，導入Sybyl X 2.0 軟件，對目標蛋白進行去除水分子、加氫原子等結構優(yōu)化，并找到靶點蛋白的對接活性位點。最后將化合物配體與蛋白質受體相互作用，對接完成后通過所得的Total Score 評價配體與受體的結合作用，評分＞6.0 認為化合物與靶點具有較好的結合能力，以此篩選TFPL 抗結直腸癌的可能有效成分，使用PyMOL1.5.0.3 軟件繪制對接結果示意圖。

3 結果

3.1 余甘子葉總黃酮對結直腸癌細胞增殖的影響

TFPL 對COLO 320DM、DLD-1 細胞均具有較好的抑制增殖作用。TFPL 分別作用24、48、72 h，對COLO 320DM 細胞的IC50值分別為60.46、36.23、23.87 μg/mL，對DLD-1 細胞的IC50值分別為157.28、95.97、49.72 μg/mL。對正常結直腸細胞NCM460 則無明顯抑制作用，IC50＞250 μg/mL。見圖1。

圖1 TFPL 對COLO 320DM、DLD-1、NCM460 細胞增殖的影響

3.2 余甘子葉總黃酮化學成分

初步鑒定得到TFPL 化學成分12 個（見表1），DAD 掃描圖和一級質譜總離子流圖見圖2。

圖2 TFPL 樣品LC-MS/MS 圖

表1 TFPL 化學成分LC-MS/MS 鑒定結果

3.3 網絡藥理學分析結果

通過ChemMapper 數(shù)據(jù)庫收集到TFPL 中10 個成分對應的100 個靶點，Corilagin 和Chebulinic acid無相關靶點數(shù)據(jù)，結果見表2。去重后得到51 個靶點，成分-靶點網絡見圖3。通過OMIM 數(shù)據(jù)庫收集到結直腸癌相關靶點192 個，見圖4。通過比對篩選出TFPL 成分和結直腸癌疾病共有靶點EGFR，提示TFPL 抗結直腸癌作用的潛在靶點為EGFR。

表2 TFPL 成分及相關靶點

圖3 TFPL 成分-靶點網絡

圖4 結直腸癌相關靶點網絡

3.4 分子對接結果

EGFR 與Quercetin、Kaempferol 能夠較好地結合（見圖5、表3），這2 個化學成分可能是TFPL 抗結直腸癌的潛在活性成分。

表3 EGFR 與潛在活性成分對接得分

圖5 EGFR 與Quercetin、Kaempferol 分子對接示意圖

4 討論

網絡藥理學建立在高通量組學數(shù)據(jù)分析、計算機虛擬計算及網絡數(shù)據(jù)庫檢索基礎上，從藥物-靶點-疾病相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復雜網絡模型表達和分析研究對象的藥理學性質。相關數(shù)據(jù)庫的建立和完善是網絡藥理學得以迅速發(fā)展的基礎，一系列用于網絡拓撲結構分析的算法、軟件為網絡藥理學模型直觀表達和數(shù)據(jù)分析提供了有力保障。網絡藥理學概念與中藥及其有效組分多層次、多靶點的機制契合度較高，適宜研究中藥多成分-多靶點的作用關系，有利于揭示中藥及其有效組分的復雜作用機制[11]。

本研究通過LC-MS/MS 鑒定獲得了TFPL 的12個化合物。利用網絡藥理學分析，篩選得出EGFR 可能是參與TFPL 抗結直腸癌作用的核心靶點。EGFR是一種跨膜蛋白，其過表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[12]。通過阻斷EGFR 在受體胞外結構域的結合位點，或抑制細胞內酪氨酸激酶活性，均可阻斷EGFR信號傳導，從而阻止腫瘤的生長[13]。分子對接結果顯示，TFPL 中的2 個成分Quercetin、Kaempferol 可與EGFR 很好結合，進一步表明EGFR 可能是TFPL 抗結直腸癌的作用靶點。Quercetin 作為一種潛在的抗腫瘤藥物已引起廣泛關注，其機制包括抗氧化和抑制激酶信號轉導等，其中包括EGFR[14]。Kaempferol 具有廣泛的生物學特性，與EGFR 具有較強的結合能力[15]，對包括結腸癌在內的多種癌細胞具有誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期的作用[16]。

綜上所述，TFPL 可能通過其活性成分Quercetin、Kaempferol 作用靶點EGFR，達到抗結直腸癌作用，本研究可為余甘子葉的進一步臨床應用和基礎研究提供參考。