趙文杰，付蒙蒙，韓愛坤，秦童童

（河南工業(yè)大學 化學化工學院，河南鄭州 450001）

美拉德反應是熱加工食品中氨基酸與還原糖類之間發(fā)生的一系列復雜反應，美拉德反應首先經(jīng)歷氨基酸的氨基與糖的羰基發(fā)生親核加成反應生成席夫堿后重排為烯醇式和酮式糖胺結構的Amadori化合物，后經(jīng)不同途徑降解為醛類、吡嗪類等具有特殊香味的揮發(fā)性化合物[1-2]。Amadori化合物是美拉德反應初級階段生成的關鍵產物，常用作指示食品熱加工程度的標志性指標[3]。通過監(jiān)測食品中Amadori化合物的含量，可以及時地反映食品加工和儲藏過程中美拉德反應的程度，從而更好地控制食品的加工和儲存條件。然而由于食品中Amadori化合物結構多樣且性質接近，因此對復雜美拉德反應體系中Amadori的準確定量分析需要對樣品前處理和色譜分離方法深入研究[4]。

Amadori化合物含有糖和氨基酸結構單元，極性較強且?guī)в须姾桑@類化合物在反相C18柱上的保留較弱，隨著新型液相色譜技術如硼酸親和色譜、反相離子配對、陽離子交換、親水相互作用的廣泛應用，逐步改善了Amadori化合物的分離問題，然而開發(fā)新的色譜分離方法仍是Amadori測定亟待解決的問題[5-10]。親水相互作用色譜（HILIC）克服了正相色譜和反相色譜在極性化合物分離過程中的不足，能夠提供與反相色譜截然不同的分離選擇性并與電噴霧離子源質譜具有很好的兼容性，為強極性和離子型化合物的分離分析提供了新的選擇[11]，由于Amadori化合物結構帶電荷且極性較強，以親水相互作用色譜對Amadori化合物進行分離具有較強的優(yōu)勢。

食品中的美拉德反應體系組成非常復雜，除了Amadori化合物之外，還含有碳水化合物、羧酸、色素、萜烯類、烷烴、類脂物、無機鹽等多種成分，如果不對食品提取液進行特異性凈化和富集以消除基質效應，則不能保證測定的靈敏度和準確性?，F(xiàn)存Amadori化合物測定的前處理方法僅包括粉碎、萃取、稀釋、等步驟，不能有效去除樣品中糖、生物堿等干擾性雜質[12-17]。因此，有必要開發(fā)針對復雜美拉德反應體系中Amadori化合物分析的樣品前處理新材料和新技術，對提取液進行特異性凈化和富集以克服樣品基質引起的質譜信號衰減現(xiàn)象。

本實驗根據(jù)Amadori化合物極性較強、同時含有糖單元和氨基酸的結構特點，提出了一種兩步固相萃取技術來提取醬油中Amadori化合物，以陽離子交換樹脂來富集Amadori和其他堿性化合物，以苯硼酸親和固相萃取來特異性保留Amadori化合物，采用親水相互作用色譜-質譜聯(lián)用技術對Amadori進行分析，建立了一種醬油中9種Amadori化合物測定的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

9種Amadori化合物包括1-脫氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala）、1-脫氧-1-L-纈氨酸-D-果糖（Fru-Val）、1-脫氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu）、1-脫氧-1-L-異亮氨酸-D-果糖（Fru-Ile）、 1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro）、1-脫氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe）、1-脫氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp）、1-脫氧-1-L-天冬酰胺-D-果糖（Fru-Asn）和1-脫氧-1-L-谷氨酸-D-果糖（Fru-Glu）購自TRC公司（加拿大），流動相甲醇、乙腈購自Sigma-Aldrich公司（美國），Oasis MCX陽離子交換固相萃取小柱（6 mL）購自Waters公司（美國），Bond Elut PBA固相萃取小柱（6mL）購自Agilent公司（美國），其他試劑均為分析純。液質聯(lián)用分析使用Agilent 1200高效液相色譜儀串聯(lián)API5500三重四極桿質譜分析系統(tǒng)（AppliedBiosystems公司）。

1.2 樣品提取與凈化

以水將1 mL醬油稀釋至20 mL，然后以0.1 mol/L鹽酸調節(jié)pH為4，將此溶液過Oasis MCX固相萃取小柱（100 mg，6 mL）后，將此小柱與Bond Elut PBA固相萃取串聯(lián)，以3 mL pH為9的氨水溶液洗脫Oasis MCX固相萃取小柱，洗脫液流過Bond Elut PBA小柱。將串聯(lián)的兩個小柱拆開，以3 mL pH為4的甲酸水溶液洗脫Bond Elut PBA（100 mg，6 mL）小柱，將此溶液定容至100 mL后以HPLC-MS/MS來測定Amadori化合物含量。使用標準曲線法對9種Amadori化合物進行定量分析，標準溶液濃度范圍為 0.005 ～ 1 μg/mL。

1.3 液質聯(lián)用分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：默克ZIC-HILIC親水相互作用色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：5 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序：0～3 min，15%A→15%A；3～5 min，15%A→30%A；5～20 min，30%A → 40%A；20～ 25 min，40%A→ 40%A；25～30 min，40%A → 15%A。流速：600 μL/min，進樣量：5 μL。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（ESI），多反應監(jiān)測正離子模式（MRM）；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：137.90 kPa；霧化氣：413.69 kPa，干燥氣：517.11 kPa；碰撞氣：62.05 kPa。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理

美拉德反應體系基質非常復雜，樣品若含有糖、氨基酸、有機酸、多羥基醇、色素等雜質，用液相色譜串聯(lián)質譜分析樣品時這些物質會與分析目標物競爭產生正離子，造成較強的基質效應，影響電噴霧離子化效率，易導致靈敏度低，降低準確性。對于非極性成分，多采用C18固相萃取小柱來凈化，同時采用Dowex離子交換樹脂保留氨基化合物去除糖，但是這種方法不能有效去除含氮堿性化合物[12-13,18]。因此本實驗根據(jù)Amadori化合物極性較強、同時含有糖單元和氨基酸的結構特點，設計了一種兩步固相萃取技術來提取Amadori化合物，首先使用強酸性陽離子交換樹脂Oasis MCX富集Amadori化合物及其他堿性化合物，同時去除糖類等其他極性酸性物質，氨水洗脫后過苯硼酸親和色譜固相萃取小柱，利用堿性條件下硼酸與順式二羥基化合物之間的親和識別作用實現(xiàn)對Amadori化合物的富集，同時去除其他雜質，然后根據(jù)硼酸與糖的反應產物在酸性條件下不穩(wěn)定的特點，以甲酸溶液洗脫Amadori化合物[19]，從而同時實現(xiàn)對美拉德反應體系中Amadori化合物的提取和凈化。

2.2 色譜質譜聯(lián)用條件優(yōu)化

Amadori化合物由糖和氨基酸組成，極性較強且?guī)в须姾?，目前對其色譜分離研究存在Amadori化合物在反相C18柱上的保留較弱、反相離子對色譜無法與質譜檢測器兼容、亮氨酸和異亮氨酸Amadori化合物難以分離等諸多問題。親水相互作用色譜（HILIC）克服了正相色譜和反相色譜在極性化合物分離過程中的不足，并與電噴霧離子源質譜具有很好的兼容性。本實驗使用乙腈和乙酸銨水溶液為流動相，在梯度洗脫模式下成功分離了9種Amadori化合物。在質譜條件優(yōu)化時，采用正離子模式，以MRM模式分別對9種Amadori化合物標準溶液進行一級質譜掃描，確定各個化合物的準分子離子峰，并分別優(yōu)化其裂解電壓，以其準分子離子為母離子，通過高純氮氣碰撞對產生的碎片離子進行二質譜掃描，同時優(yōu)化碰撞能量。選擇豐度較高的碎片離子為定性和定量特征離子。通過優(yōu)化，9種Amadori化合物的色譜保留、定性與定量特征離子及優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表1。

表1 Amadori化合物的色譜保留和質譜優(yōu)化參數(shù)

2.3 方法評價

2.3.1 基質效應

基質效應的存在會對分離分析方法的準確度及靈敏度產生重大影響。在本實驗中，通過對比純化后樣品基質與溶劑標準溶液曲線的斜率，評估了基質效應對檢測結果的影響。對比兩條標準曲線的斜率，發(fā)現(xiàn)二者比值在0.87～1.12的允許范圍內，說明本方法不產生干擾試驗準確性的基質效應。

2.3.2 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將配好的標準溶液進樣分析，得到對應9種Amadori化合物的標準曲線、線性方程、相關系數(shù)、線性范圍。選用一定濃度的標準溶液，連續(xù)進樣10次，得到每種Amadori化合物的標準偏差（SD），以3SD作為檢出限，10SD作為定量限，結果如表2所示。該方法的線性范圍良好，定量限在30 ～ 45 μg/mL。

表2 方法的線性、相關系數(shù)和檢測限

2.3.3 回收率和重復性

使用市售的醬油樣品考察了方法的回收率和重復性，精確量取醬油1 mL并進樣分析，平行6次，得到每種Amadori化合物的RSD，結果為3.1%～7.2%。如表3所示，說明方法的精密度良好。對此醬油樣品分別加入高低2個濃度水平的標準溶液。將所得樣品處理后進樣分析，每個進樣3次。得到9種Amadori化合物回收率為83.4%～110.2%，RSD為2.4%～7.3%，說明方法回收率良好。

表3 方法的回收率和精密度

3 結論

本實驗開發(fā)了一種測定醬油中Amadori化合物的樣品前處理方法，將醬油樣品調成弱酸性后過強酸性陽離子交換樹脂，以氨水溶液洗脫，將洗脫液過苯硼酸親和固相萃取小柱，以甲酸水溶液洗脫Amadori化合物，實現(xiàn)對醬油樣品中Amadori化合物的提取和凈化。本方法簡單、快速、高靈敏、高通量，尤其在去除基質中干擾物方面表現(xiàn)出高選擇性，提高了Amadori化合物測定的靈敏度和準確性，有望進一步拓展更多復雜食品體系中Amadori化合物的測定方法。