朱 虹

（河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊 050026）

動(dòng)物源食品中的抗生素殘留主要是由于動(dòng)物在飼養(yǎng)過(guò)程中不可避免地使用抗生素而造成的，人們?nèi)糸L(zhǎng)期攝入抗生素殘留的食物，會(huì)導(dǎo)致抗生素在體內(nèi)積蓄，使人們產(chǎn)生毒性和抗藥性等一系列健康問(wèn)題[1-2]。因此，建立快速、簡(jiǎn)單、低成本的動(dòng)物源食品中抗生素殘留的檢測(cè)方法具有重要意義。

目前，抗生素同時(shí)檢測(cè)使用比較多的方法是液質(zhì)聯(lián)用法[3-4]，但此方法對(duì)儀器設(shè)備要求高，價(jià)格昂貴，難以達(dá)到普及的程度。高效液相色譜儀（HPLC）普及率較高，具有分析檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本文建立了HPLC法測(cè)定動(dòng)物源食品中阿莫西林、土霉素、四環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素6種抗生素殘留的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（日本島津）；ZD-2 pH計(jì)（上海雷磁）；ATY124電子天平（日本島津）；KS-3200E超聲波清洗器（昆山市潔力美超聲儀器有限公司）；800B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；XH-B旋渦混合器（天翎儀器）；HN200氮吹儀（海能儀器）。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：甲砜霉素購(gòu)自上海阿拉丁公司；阿莫西林和氟苯尼考購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；土霉素、四環(huán)素和氯霉素購(gòu)自上海源葉生物科技公司；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；甲酸、EDTA、正己烷等試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別稱(chēng)取一定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈-水（4∶1，V/V）溶解，制備成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20 ℃避光密封保存。

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取1.5 g剁碎并勻質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水-0.1 mol/L EDTA溶液（15∶4∶1，V/V/V），渦旋振蕩3 min，4 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL離心管中，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋振蕩5 min，靜置3 min，棄去正己烷層，將提取液轉(zhuǎn)移至氮吹儀用管中進(jìn)行氮吹濃縮，再用流動(dòng)相初始比例復(fù)溶，0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Agilent ZORBAX SB-C18,5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：乙腈-甲酸溶液（pH2.50）在0～3 min內(nèi)為18∶82（V/V），在3～15 min內(nèi)變?yōu)?3∶67（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種抗生素分離色譜圖

采用液相色譜儀（二極管檢測(cè)器）檢測(cè)6種抗生素，結(jié)果表明，12 min內(nèi)其可對(duì)6種抗生素進(jìn)行分離檢測(cè)，且分離效果良好。6種抗生素分離色譜圖，如圖1所示。

圖1 6種抗生素分離色譜圖

2.2 樣品前處理

在動(dòng)物源性食品中抗生素殘留檢測(cè)中，乙腈是應(yīng)用最多的提取劑[5]，乙腈-水體系對(duì)各類(lèi)型的獸用抗生素都有較好的溶解能力且具有沉淀蛋白的作用。另外，EDTA可防止四環(huán)素、土霉素與樣品中的重金屬發(fā)生絡(luò)合，所以在乙腈-水體系中加入了EDTA溶液。當(dāng)乙腈-水-0.1 mol/L EDTA溶液為15∶4∶1（V/V/V）時(shí)，提取效果最佳，雜質(zhì)干擾較小，回收率較高。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

選取了甲醇體系和乙腈體系作為流動(dòng)相，研究發(fā)現(xiàn)，甲醇體系分離效果不好，且運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)，而乙腈-甲酸體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化能在比較短的時(shí)間內(nèi)將6種抗生素進(jìn)行分離，最終選取乙腈-甲酸體系作為流動(dòng)相。

2.4 甲酸溶液pH值的選擇

本文選取pH值為2.0、2.5、 3.0、3.5和4.0的甲酸溶液進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)甲酸溶液的pH為2.5時(shí)，6種抗生素的分離效果最佳。

2.5 不同柱溫對(duì)樣品峰型的影響

本文考察了25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃這4種柱溫對(duì)6種抗生素分離的影響，結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，色譜峰的出峰時(shí)間整體縮短，但土霉素和四環(huán)素分離效果變差。當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，6種抗生素整體分離效果較好，出峰時(shí)間適合且峰形較好。

2.6 回歸分析及檢出限

量取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照1.3.3的流動(dòng)相初始比例分別將其稀釋成25 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，利用HPLC由低濃度到高濃度依次進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，以平均峰面積值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以3倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的濃度為定量限（LOD），結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，6種抗生素在25～100 μg/kg，6種抗生素的線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為8～9 μg/kg，定量限為 27 ～ 30 μg/kg。

表1 6種抗生素線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.7 加標(biāo)回收率

稱(chēng)取1 g空白樣品，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制成40 μg/kg的空白添加樣品，按照1.3.2法處理后，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，樣品的加標(biāo)回收率為84.8%～91.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～4.3%。表明方法穩(wěn)定且重現(xiàn)性好。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)肉源性食品中阿莫西林、土霉素、四環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素6種抗生素的提取優(yōu)化和檢測(cè)方法的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了12 min內(nèi)梯度分離6種抗生素，且該方法操作簡(jiǎn)單，快速高效，可為肉源性食品中多抗生素殘留的檢測(cè)提供參考依據(jù)。