崔 霞

（常州市武進區(qū)疾病預防控制中心，江蘇常州 213100）

近年來，沙門氏菌造成食物中毒的事件頻繁出現。動物性食品是沙門氏菌重點污染的對象，動物的貯藏、運輸、銷售、屠宰加工等步驟都易被沙門氏菌污染[1]。豬肉是我國居民的核心肉類食品之一，對沙門氏菌在豬肉產業(yè)鏈中的實際污染以及傳播情況進行及時監(jiān)測，有利于進一步保證豬肉安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬肉，隨機選擇3個超市以及6個市場。三塘鐵（TSI）瓊脂、HE瓊脂、MH肉湯（MHB）、尿素瓊脂、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、糖發(fā)酵管、TT、MH瓊脂（MHA）、BPW、Taq酶、瓊脂糖、dNTP、溴化 乙 錠（EB）、MgCl2、DNA Marker DL2000、10×Buffer。

1.1.2 儀器與設備

YM75高壓蒸汽滅菌鍋；IKAT25數顯型分散機；Heraeus Muhifuge X3R高速冷凍離心機；SPX-250-Ⅲ生化培養(yǎng)箱；BIO-RAD凝膠成像分析儀；Mixone漩渦振蕩器；QS-DX7實時熒光定量PCR；微量注射器、BY-C18臺式離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙門氏菌在豬肉中的分離、鑒定

（1）樣品采集。使用無菌手術刀取豬腿肉250 g，將其放進滅菌容器、保溫箱內，第一時間帶回實驗室進行檢驗。

（2）沙門氏菌的分離和鑒定。對PCR檢測呈陽性的肉樣開展沙門氏菌的鑒定和分離[2]，參考相關方法實施操作。采取接種環(huán)取1環(huán)TTB增菌液，劃線接種在BS、HE瓊脂平板上對沙門氏菌進行分離。接著采用賴氨酸脫羧酶實驗培養(yǎng)基、尿素瓊脂以及三糖鐵瓊脂、氰化鉀培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管等來鑒定沙門氏菌。

1.2.2 豬肉中沙門氏菌的PCR檢測

（1）特異性與廣譜性檢驗。在LB液體培養(yǎng)基中接種不同的沙門氏菌以及其他非沙門氏菌菌株，在175 r/min、37 ℃條件下開展純菌培養(yǎng)24 h，提取DNA模板實施PCR擴增，采用電泳法對擴增產物進行檢測[3]。

（2）實用性檢驗。依次培養(yǎng)沙門氏菌菌株以及志賀氏菌、大腸桿菌等其他菌株，接著將它們混合取100 μL對1份25 g|無菌豬肉樣品進行感染[4]。把感染之后的樣品在適宜溫度下放置2～5 h后，用225 mL生理鹽水進行浸泡，在45 mL LB液體培養(yǎng)基中添加5 mL浸泡液，在37 ℃下培養(yǎng)5 h，取1 mL培養(yǎng)物用來進一步提取DNA模板開展PCR擴增，采用電泳法對其產物進行檢測[5]。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌在豬肉中的分離、鑒定結果分析

從市場以及超市一共采集83份豬肉樣品，其中超市、市場分別為14份、69份。肉樣里面的熱鮮肉以及冷卻肉分別為39份、44份。

從豬肉樣品中一共分離到21株沙門氏菌，沙門氏菌的檢出率達到了25.3%。超市、市場中冷卻肉的沙門氏菌檢出率是14.3%、13.3%，兩者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。冷卻肉、熱鮮肉的沙門氏菌檢出率是13.6%、38.5%，兩者之間差異顯著（P＜0.05）。超市、市場中肉樣的沙門氏菌檢出率是14.3%、27.5%，兩者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 豬肉中沙門氏菌的PCR檢測

2.2.1 特異性與廣譜性

本試驗共檢測了8種不同的沙門氏菌以及非沙門氏菌，擴增結果如圖1、2所示。8種不同的沙門氏菌都可以擴增出如圖1中的特異性條帶，片段長度擴增到516 bp，與目標片段長度相同；圖2中沒有產生條帶的泳道是非沙門氏菌，實驗里面用的陰溝桿菌、金色葡萄球菌、志賀氏菌、檸檬酸桿菌以及大腸桿菌不能被這一引物擴增。結果表明，這類引物不僅具有一定的廣譜性，可以用于擴增各種沙門氏菌，而且這類引物的特異性非常高，無法擴增非沙門氏菌。

圖1 沙門氏菌PCR擴增電泳圖

圖2 沙門氏菌和其他菌PCR擴增電泳圖

2.2.2 實用性

用沙門氏菌與其他混菌、單菌對豬肉樣品進行感染，經短期培養(yǎng)之后，提取DNA開展PCR擴增，其結果充分表明，經沙門氏菌陽性感染的樣品都可以擴增出目標條帶，而陰性感染的樣品不能擴增出條帶，如圖3。

圖3 混合培養(yǎng)物PCR擴增電泳圖

在細菌濃度很高的情況下，全部的沙門氏菌陽性樣品都可以擴增出特異性條帶，混合培養(yǎng)物感染與純菌感染的結果相同。當細菌的濃度達到了103cfu/mL的時候，純菌感染樣品的陽性檢出率比混合感染樣品高。其核心原因是混合感染樣品經過增菌后，沙門氏菌以及非沙門氏菌共同增長，在整個細菌濃度中非沙門氏菌占了較大的比例，而沙門氏菌的濃度可能低于103cfu/mL，進而導致最終獲取的有效模板濃度太低，乃至PCR反應體系不能擴增出條帶[6]。另外，盡管常規(guī)PCR對模板的相關要求不高，可模板品質的好壞也是PCR反應是否順利開展的一個核心因素。太多的非目標模板DNA也許會影響引物對模板DNA的準確識別，使擴增效率不斷降低。

3 討論與結論

在豬肉中沙門氏菌的分離、鑒定實驗中，重點檢測了沙門氏菌在豬肉中的實際檢出情況，結果表明，本地區(qū)豬肉的微生物污染很嚴重，沙門氏菌檢出率非常高；此外冷卻肉的品質優(yōu)于熱鮮肉，集貿與超市出售的肉的品質沒有太大差異。

本實驗沒有對沙門氏菌開展耐藥基因的檢測與血清型的鑒定。血清型的相關鑒定能夠將污染源顯示出來，部分血清型與環(huán)境、特定的產品有關，利用血清學的相關知識可以追蹤流行病，明確食物中毒事件的具體污染源。耐藥基因的相關檢測有利于為耐藥性的出現以及傳播提供有效、真實的信息。于是為了更好地評估耐藥沙門氏菌在肉類食品中的實際風險，還需要深入研究分離菌株的耐藥基因檢測與血清型鑒定。

在豬肉中沙門氏菌的PCR檢測實驗中，對豬肉樣品與混合培養(yǎng)物中提取的DNA模板實施了擴增，并且獲取了不錯的成效。因為DNA模板的用量較小，細菌培養(yǎng)物的濃度太低的時候，會使得DNA模板濃度太低，進而無法檢測出特異目標條帶。唯有簡化操作步驟、減少PCR檢測成本，PCR檢測技術才可以在現實生產中獲得有效的應用。