周鍵超，韋雪飛，羊超菠

（磐安縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江磐安 322300）

鐵皮石斛，學(xué)名為Dendrobium officinaleKimura et Migo，是蘭科石斛屬草本植物，生于海拔1 600 m的山地半陰濕的巖石上，主要分布于我國安徽、浙江、福建等地區(qū)[1]，鐵皮石斛以其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥，益胃生津，滋陰清熱。鐵皮石斛成分復(fù)雜，包括石斛多糖、生物堿、黃酮、酚類物質(zhì)、石斛其他類結(jié)構(gòu)物質(zhì)及微量元素等[2]，為食藥同源中藥材。浙江省磐安縣是“中國藥材之鄉(xiāng)”，全縣有家種和野生中草藥1 219種，“浙八味”中白術(shù)、元胡、玄參、貝母和白芍主產(chǎn)于磐安，俗稱“磐五味”，2016年，鐵皮石斛與三葉青、靈芝、玉竹、天麻被評為新磐五味。作為道地藥材之一，鐵皮石斛在種植、藥用、臨床等研究方法發(fā)揮著重大作用，但對鐵皮石斛原料中有機氯農(nóng)藥多殘留研究有所欠缺。人工栽培、生長環(huán)境等會造成中藥材中農(nóng)藥不同程度的殘留[3]，但《中國藥典》2020版中未對鐵皮石斛農(nóng)藥殘留有明確限量指標(biāo)[4]，這不僅影響藥材的用藥安全，也不利于中藥材出口走出國門及助推產(chǎn)業(yè)更好發(fā)展。因此，研究并制定簡單、快速、準(zhǔn)確，并可同時定性、定量的農(nóng)藥多殘留檢測方法是保障人們用藥安全、推動中藥材現(xiàn)代化建設(shè)迫切需要結(jié)果的問題之一[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抽樣市面銷售鐵皮石斛；氯化鈉（分析純）；乙腈（色譜純）；正己烷（色譜純）；中藥農(nóng)殘專用柱HLB-A（納普分析技術(shù)（蘇州）有限公司）；13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品具體見表1。

表1 13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品表

1.2 儀器設(shè)備

賽默飛TRACE1300氣相色譜儀，配有ECD檢測器（賽默飛世爾科技）；電子天平AL204/01（梅特勒-托利多公司）；多管漩渦混合儀GL-50（杭州金譜科學(xué)儀器有限公司）；智能氮吹儀MFV-24（廣州得泰儀器科技有限公司）；臺式高速離心機ST8（蘇州Thermo）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Precision（海道爾夫）。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備與提取

取鐵皮石斛樣品，將其磨碎過80目篩，制成待測樣。取待測樣粉末2.5 g，精密稱量，加入氯化鈉1 g，搖散后加入乙腈25 mL，以2 500 r/s渦旋混勻5 min，4 500 r/min離心5 min，分取上清液于平底燒瓶內(nèi)，沉淀再加乙腈25 mL，渦旋5 min，離心5 min，合并兩次上清液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)上清液減壓濃縮至3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻，即得。

1.3.2 凈化

量取直接提取法制備的供試品溶液3～5 mL,直接通過親水親油平衡材料（HLB SPE）固相萃取柱（200 mg，6 mL），收集全部凈化液，搖勻。吸取1.0 mL搖勻后的凈化液置水浴氮吹儀氮吹至近干，用正己烷定容至1.0 mL，過0.2 μm濾膜過濾進行測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）準(zhǔn)確吸取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mL，于10.0 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，此時溶液濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃保存。用鐵皮石斛基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存，備用。

（2）準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 μg/mL）0.10 mL，用正己烷定容至1.0 mL，此時混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為0.10 μg/mL。

（3）分 別 準(zhǔn) 確 吸 取 混 合 標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液（0.10 μg/mL）0.01 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL和0.50 mL，用正己烷定容至1.0 mL，此時混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.001 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL 和 0.050 μg/mL。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：SPB-530 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度：240 ℃；升溫程序：90 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升至180 ℃并保持5 min，以4 ℃·min-1的速率升至280 ℃并保持10 min；檢測器溫度：300 ℃；進樣量：1 μL；載氣及流速：50 mL/min；定量方法：峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的色譜表色譜圖

13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示，具體參數(shù)見表1。

圖1 13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

表1 13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的色譜表

2.2 提取過程中直接加乙腈的考察

在對鐵皮石斛粉末進行提取過程中，觀察到加入水浸潤粉末后再加乙腈，會因為鐵皮石斛糖分多而發(fā)生黏連情況，導(dǎo)致最后回收率過低；而不加水直接乙腈提取，則沒有黏連情況，添加回收率也較好，因此選擇提取過程中直接加乙腈。

2.3 定容溶劑選擇

對鐵皮石斛粉末中13種有機氯農(nóng)藥多殘留的檢測中，選擇乙腈進行提取，離心完過濾濃縮凈化后較為清澈，且能充分提取出農(nóng)藥殘留，但選擇乙腈作為定容溶劑時，上機過程中發(fā)現(xiàn)溶劑響應(yīng)值偏大，在做低濃度添加回收時有較大影響，故選擇凈化后取1 mL水浴氮吹至近干，換正己烷對其進行定容。

2.4 線性范圍

用以上混合標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液配制的基質(zhì)標(biāo)，在1.3.4條件下進行測定，分別以各組分的溶液濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從曲線結(jié)果上看，13種有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在0.001～0.100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.997 0），滿足定量分析要求，同時，該條件下測定的檢出限定量限均滿足《中華人民共和國藥典》2020版四部有機氯農(nóng)藥殘留要求。13種有機氯農(nóng)藥殘留的線性關(guān)系見表2。

表2 13種農(nóng)藥線性范圍、線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)表

2.5 回收率和精密度

對空白均質(zhì)的鐵皮石斛樣品基質(zhì)分別做低、中、高3種添加回收實驗，每個水平重復(fù)6次，均按照1.3方法進行實驗，測定回收率及精密度，實驗結(jié)果表明，該方法下的添加回收率和精密度基本滿足農(nóng)藥殘留分析方法規(guī)定的相關(guān)要求。11種有機氯農(nóng)藥殘留在3個水平下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍（n=6）見表3、表4。

表3 11種有機氯農(nóng)藥在3個水平下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍表（n=6）

表4 2種有機氯農(nóng)藥在3個水平下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍表（n=6）

2.6 實際樣品應(yīng)用

根據(jù)以上實驗方法，抽取了本地市面銷售的10批鐵皮石斛樣品，對其分別進行上述13種有機氯農(nóng)藥多殘留檢測，結(jié)果見表5。實驗結(jié)果顯示，10批鐵皮石斛樣品中，13種有機氯農(nóng)藥殘留部分未檢出，檢出的均低于《中華人民共和國藥典》2020版四部有機氯農(nóng)藥殘留要求的定量限。

表5 鐵皮石斛樣品有機氯農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果表

3 結(jié)論

從檢測結(jié)果看，該實驗方法建立了鐵皮石斛原料中13種有機氯農(nóng)藥多殘留檢測方法：用乙腈對鐵皮石斛粉末進行提取，過親水親油平衡材料（HLB SPE）固相萃取柱凈化，凈化液氮吹至近干用正己烷定容。該方法下得出的各農(nóng)藥回收率均在60.01%～120.31%，RSD在0.846%～9.792%，符合農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)，同時該方法高速、有效，可推廣并應(yīng)用于鐵皮石斛原料中的有機氯農(nóng)藥的殘留檢測。