杜 清，陳 志，吳 江，劉明地，郭蘇城，候永強(qiáng)

1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院 青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省藥物分析學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810007

2.青海師范大學(xué) 青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007

3.青海民族大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，青海 西寧 810007

4.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海 西寧 810007

罌粟科（Papaveraceae） 荷包牡丹亞科（Fumarioideae）紫堇屬CorydalisL.的植物全世界有428 種，中國有298 種，其中斑花黃堇Corydalis conspersaMaxim.Fl.Tang.為紫堇屬多年生草本植物[1]，青藏高原和西藏地區(qū)有210 多種[2-3]，藏醫(yī)作為“當(dāng)日絲哇”使用[4]。紫堇屬的植物含有多種生物堿成分，主要包括異喹啉類、有機(jī)胺類、異吲哚類、原阿片堿類、原小檗堿類、苯酞異喹啉類、螺芐異喹啉類、芐基異喹啉類、阿樸菲類、枯拉靈類、苯菲啶類及其他類別的異喹啉類生物堿[5]。研究表明斑花黃堇中含有黃連堿、巴馬亭、原阿片堿、血根堿、比枯枯靈、紫堇堿、四氫非洲防己胺7 種生物堿成分[6-7]。

根據(jù)已有研究報(bào)道[8]，《中國藥典》2020年版中對(duì)于藥材中生物堿的檢測(cè)情況及斑花黃堇藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的要求，本研究采用一測(cè)多評(píng)法首次測(cè)定斑花黃堇各個(gè)部位中鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿、比枯枯靈4 種生物堿的含量，為斑花黃堇藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 斑花黃堇藥材的采集及處理 藥材于2017年8月采于青海省黃南州河南縣吉崗山、青海省海北藏族自治州祁連縣祁連山、青海省玉樹藏族自治州囊謙縣香龍峽谷山、青海省海南州貴德縣拉脊山，經(jīng)青海民族大學(xué)林鵬程教授鑒定為斑花黃堇C.conspersaMaxim.Fl.Tang.，樣品信息見表1。將新鮮植物清洗干凈后，分成根、莖、葉、花不同部位，陰干，粉碎后過60 目篩備用。

表1 斑花黃堇樣品信息Table 1 Sample information from C.conspersa

1.1.2 對(duì)照品及試劑 對(duì)照品鹽酸小檗堿購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院（批號(hào)633-65-8），質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%；黃連堿購于上海寶曼生物有限公司（批號(hào) 170316YX-1）；原阿片堿（批號(hào)161223WTA）、比枯枯靈（批號(hào)161009HXY）購于上海寶曼生物有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%；乙腈（Fisher Chemical，HPLC 級(jí)，LOT166579）。濃鹽酸（天津市博迪化工有限公司）、氫氧化鈉、無水乙醇、95%乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇（西隴化工股份有限公司），二氯甲烷（天津富宇化學(xué)試劑公司），水（杭州娃哈哈有限公司），以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters Alliance 高效液相色譜系統(tǒng)：配有2695 溶劑管理系統(tǒng)、2996 二極管陣列檢測(cè)器和Empower 色譜工作站，儀器型號(hào)分別是Waters2695 和島津LC-20AT，UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì)（島津公司），AYALA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100（上海愛朗儀器有限公司），實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（沃特普公司），SB5200 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），微量移液器（ORAGON LAB），BSA1245 型電子天平（德國賽多利斯公司）。

色譜柱均為C18柱，分別搖光B18120405.25（江蘇漢邦科技有限公司）、Phenomenex（飛諾美公司）和6L Sciences（日本GL Sciences），無菌注射器（江蘇常州醫(yī)療器械總廠），微孔濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取條件的選擇

生物堿成分可應(yīng)用酸提堿沉法[9-10]提取分離，斑花黃堇中總生物堿提取工藝[11]，采用0.5%鹽酸提取后用5%氫氧化鈉堿沉，調(diào)至不同pH 值（pH 8～9、10～11、11～12），靜置過夜后，將各種堿性水溶液分別用二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取3 次后合并相同萃取溶劑的萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸干有機(jī)溶劑后用95%乙醇溶解移液至量瓶，定容至10.0 mL 后，用紫外分光光度計(jì)在波長200～550 nm 處掃描紫外吸收情況，每份溶液平行測(cè)定3 次。斑花黃堇藥材中的生物堿成分極性較低，pH 9～12 二氯甲烷萃取相95%乙醇溶液在波長200～350 nm 及430 nm 左右都有多個(gè)吸收峰，且強(qiáng)度和吸光度均較強(qiáng)，尤其pH 11～12 各個(gè)峰的吸光度最大；而各種pH 條件下醋酸乙酯、正丁醇萃取相的95%乙醇溶液在波長200～350 nm 未見強(qiáng)的吸收峰，尤其430 nm 左右均未見吸收峰（鹽酸小檗堿95%乙醇溶液的吸收峰之一），故選擇二氯甲烷萃取堿沉溶液（pH 11～12）提取斑花黃堇總生物堿[11]。

2.2 色譜條件

色譜柱：B18120405.25 搖光C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%的醋酸水溶液，梯度洗脫，0～5 min，25%乙腈；6～10 min，25%～30%乙腈；11～15 min，30%～35%乙腈；16～25 min，35%～25%乙腈。體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長為245 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量50 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 單一對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈對(duì)照品各適量至容量瓶中，95%乙醇溶解，配制成含鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈0.216、0.024、0.190、0.060 mg/mL的單一對(duì)照品溶液，以上溶液超聲10 min，搖勻，定容，靜置備用。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液 分別用移液槍精密吸取鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈的單一對(duì)照品95%乙醇溶液各0.5 mL，加入至2.0 mL 量瓶混勻，密封，靜置備用，此時(shí)混合對(duì)照品溶液中鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈的質(zhì)量濃度分別為0.054、0.006、0.047 5、0.015 mg/mL。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取斑花黃堇藥材粉末0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入0.5%鹽酸溶液20 mL，密塞，超聲10 min，靜置過夜，抽濾酸提取溶液后用5%NaOH 沉淀，用酸度計(jì)調(diào)pH 值至11～12，超聲10 min 后靜置過夜，用二氯甲烷每次30 mL，萃取3 次后的萃取液放置于250 mL三角錐形瓶中，旋干有機(jī)溶劑，用95%乙醇溶液溶解，超聲5 min，搖勻并定容至2.0 mL 量瓶，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，密封。

2.4 方法學(xué)考察[12-13]

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 應(yīng)用“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，混合對(duì)照品溶液和斑花黃堇藥材供試品溶液中的鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈4 個(gè)生物堿峰和峰之間的分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于4000，混合對(duì)照品及供試品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A) 和斑花黃堇樣品 (B) HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and C.conspersa (B)

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)中混合對(duì)照品溶液各50、35、25、15、10、1 μL 進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3 次，取平均值。分別以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍，同系列混合對(duì)照品按照制備方法逐級(jí)稀釋，分別以信噪比3 和10 考察檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 4 種生物堿對(duì)照品的線性關(guān)系和線性范圍Table 2 Linear correlation and ranges of four alkaloids reference substances

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品（批號(hào)BHHJ-JGS-R）溶液50 μL 連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 分別為0.31%、0.53%、1.23%、0.26%；峰面積的RSD 分別為1.29%、3.63%、3.73%、1.45%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品（批號(hào)BHHJ-JGS-R）溶液50 μL，分別于配制后的0、4、12、24 h 測(cè)定其中鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈的保留時(shí)間和峰面積，得保留時(shí)間的RSD分別為0.93%、1.13%、1.12%、0.15%；峰面積的RSD分別為1.52%、1.97%、1.84%、2.72%。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取斑花黃堇藥材根（批號(hào)BHHJ-JGS-R）粉末共6 份0.1 g，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下制備樣品，測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為969.64、773.83、432.59、500.64 μg/g，RSD 分別為3.64%、1.71%、2.80%、2.83%。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取適量已測(cè)定的斑花黃堇粉末9 份，按“2.3.3”項(xiàng)下分別制備供試品溶液后定容至6.0 mL，取供試品溶液0.3 mL，分別精密加入“2.3.2”項(xiàng)下低、中、高3 個(gè)劑量的混合對(duì)照品各0.4、0.5、0.6 mL，每個(gè)劑量平行3 份，制備樣品后混勻，按照色譜條件測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿、黃連堿、原阿片堿和比枯枯靈的加樣回收率分別為98.83%、102.03%、100.52%、100.47%，RSD 分別為1.31%、1.46%、0.45%、1.52%。

2.5 相對(duì)校正因子（fs/i）[13-14]的計(jì)算

采用多點(diǎn)校正法，精密吸取混合對(duì)照品溶液各30、35、40、45、50 μL，按照“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3 次，取平均值計(jì)算。以鹽酸小檗堿（s）為內(nèi)參物，根據(jù)fs/i的計(jì)算公式[fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)]計(jì)算比枯枯靈、黃連堿、原阿片堿與內(nèi)參物鹽酸小檗堿間的fs/i，結(jié)果3 個(gè)待測(cè)成分與內(nèi)參物的fs/i的RSD 值均小于5%，見表3。

表3 不同進(jìn)樣體積對(duì)fs/i 的影響Table 3 Influence on relative correction factor from different injection volume

2.6 fs/i耐用性考察

2.6.1 不同柱溫考察 采用Waters 2695 高效液相色譜儀和搖光C18色譜柱，考察不同柱溫（25、30、35 ℃）對(duì)斑花黃堇中生物堿成分fs/i的影響，結(jié)果各種成分與內(nèi)參物的fs/i重現(xiàn)性良好（RSD＜5%），見表4。

表4 不同柱溫對(duì)fs/i 的影響Table 4 Influence on relative correction factor from different column temperature

2.6.2 不同體積流量考察 采用Waters 2695 高效液相色譜儀和搖光C18色譜柱，考察不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）對(duì)斑花黃堇中生物堿成分fs/i的影響，結(jié)果各種成分與內(nèi)參物的fs/i重現(xiàn)性良好（RSD＜5%），見表5。

表5 不同體積流量對(duì)fs/i 的影響Table 5 Influence on relative correction factor from different volume

2.6.3 不同儀器和色譜柱的考察 分別考察了Waters 2695和島津LC-20AT 高效液相色譜儀及瑤光C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和6L Sciences（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對(duì)fs/i的影響，檢測(cè)波長為245 nm，并計(jì)算RSD，結(jié)果RSD 均小于5%，表明fs/i在不同的儀器和色譜柱的適用性良好，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器和色譜柱對(duì)fs/i 的影響Table 6 Influence on relative correction factor from different instruments and columns

通過斑花黃堇中各種生物堿對(duì)于鹽酸小檗堿的fs/i的測(cè)定和耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，不同進(jìn)樣體積、不同柱溫、不同體積流量、不同儀器和色譜柱對(duì)fs/i均無明顯影響。

2.7 待測(cè)組分色譜峰定位

根據(jù)“2.5”項(xiàng)中得到的保留時(shí)間計(jì)算待測(cè)成分（i）與鹽酸小檗堿（內(nèi)參 s）的相對(duì)保留值（ri/s=tRi/tRs），對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定位，并計(jì)算 RSD，結(jié)果各待測(cè)成分相對(duì)保留值的RSD 均小于5%，表明采用的研究體系能有效且穩(wěn)定檢測(cè)待測(cè)成分。結(jié)果見表7。

表7 不同條件下對(duì)ri/s 的影響Table 7 Influence of different injection volume,column temperature,volumn,instruments and columns on ri/s

2.8 藥材中4 種生物堿的含量測(cè)定

將不同采集地區(qū)的藥材，采用“2.3.3”項(xiàng)下方法制備樣品并精密吸取溶液50 μL 自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。分別采用一測(cè)多評(píng)法[14]，以鹽酸小檗堿對(duì)照品峰面積為對(duì)照，同時(shí)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各個(gè)采樣地區(qū)樣品中的比枯枯靈、黃連堿、原阿片堿的含量及RSD 值，結(jié)果見表8，RSD均＜5.0%，計(jì)算結(jié)果并無顯著性差異，說明一測(cè)多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法均可行的。故應(yīng)用一測(cè)多評(píng)法的結(jié)果繪制各個(gè)采樣地區(qū)不同組織部位藥材中4 種生物堿的含量和積累含量情況圖，見圖2、3。

表8 斑花黃堇藥材中4 種生物堿的含量測(cè)定結(jié)果 (n＝3)Table 8 Determination results of four alkaloids from drugs of C.conspersa (n＝3)

從表8及圖2、3 可看出，斑花黃堇藥材各個(gè)組織中原阿片堿、鹽酸小檗堿的含量較高，不同組織部位各種生物堿的含量差別較大。不同采集地區(qū)根部4 種生物堿的含量比莖、葉、花中高，因?yàn)樯L年限和海拔高度、生態(tài)環(huán)境的不同，4 種生物堿成分的含量：根部海南州、玉樹州地區(qū)高于黃南州、海北州；莖部玉樹州地區(qū)高于海南州、黃南州、海北州；4 個(gè)采集地區(qū)葉、花部4 種生物堿的積累含量相對(duì)于根、莖部均較少。4 種生物堿中原阿片堿、鹽酸小檗堿的含量在各個(gè)采集地區(qū)的根、莖、葉中含量較高，花中鹽酸小檗堿的含量最高。該結(jié)果為今后藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量分析提供依據(jù)。

圖2 不同來源斑花黃堇藥材中生物堿的積累量Fig.2 Accumulated contents of alkaloids from different origin drug of C.conspersa

圖3 不同來源斑花黃堇藥材中4 種生物堿總量Fig.3 Contents of four alkaloids from different origin drug of C.conspersa

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

結(jié)合實(shí)際研究色譜圖，可看到的波長有210、212、224、228、245、254、345、359、394 nm，對(duì)靈敏度、檢測(cè)限和各個(gè)成分的分離度、最大吸光度情況進(jìn)行考察，并結(jié)合已有的報(bào)道文獻(xiàn)[15-16]，結(jié)果表明，檢測(cè)波長為245 nm 時(shí)，基線較穩(wěn)定，4 個(gè)生物堿成分的色譜分離度最好，且各個(gè)峰的吸光度最大，故以245 nm 作為檢測(cè)波長。

3.2 色譜柱的選擇

反相色譜是分析生物堿的常用方法，色譜柱的固定相采用常規(guī)的C18柱，高純的硅膠基質(zhì)，填料的粒徑在5 μm，耐酸堿，且高密度鍵合和完全封尾的技術(shù)，選擇pH 值1.5～10.5 寬范圍以適應(yīng)不同性質(zhì)的生物堿，柱長為25 cm 達(dá)到有效分離。

3.3 檢測(cè)方法和流動(dòng)相的選擇

目前可常規(guī)應(yīng)用紫外和HPLC 的方法檢測(cè)斑花黃堇藥材中生物堿成分，本研究中對(duì)流動(dòng)相的不同比例及不同pH 值的醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果，pH 4.8 為最佳[17-18]，4 種生物堿成分的分離度最好，且4 個(gè)峰的保留時(shí)間均在11 min 以內(nèi)。由此說明此研究實(shí)驗(yàn)中有機(jī)溶劑和酸水溶液配比的流動(dòng)相能有效分離且節(jié)約時(shí)間有效檢測(cè)出4 種生物堿成分。

HPLC 研究中應(yīng)用酸提堿沉法精細(xì)分離出總生物堿，根據(jù)已有紫外分光光度法研究總生物堿的含量，可看出應(yīng)用紫外吸收光譜檢測(cè)的總生物堿的含量比單體生物堿成分的含量高的多，而同樣單體生物堿成分用不同的取樣量以及檢測(cè)方法測(cè)定的含量也有不小的差別，會(huì)因?yàn)樘崛∵^程中的損失，也會(huì)因?yàn)闄z測(cè)的限度范圍不同，尤其莖、葉花中各種生物堿的成分含量低。

志謝：青海師范大學(xué)陳克龍教授、馬友貴教授、尚軍教授、程子毓教授、熊雯豆、魏杰鋒、李嶺、焦璐等師生處理藥材、準(zhǔn)備儀器和實(shí)驗(yàn)條件；青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院工作人員對(duì)于研究的支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突