姜進平 朱鐘鐘 黃耿 程凱 羅海平 袁又能 李新明 熊仁海 鄭安銳

1鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院胃腸肛腸外科 435000；2鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院泌尿外科 435000；3鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 435000

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其病死率居男性惡性腫瘤的第2位［1］。我國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，胃癌的發(fā)病率和病死率均較高［2］。大多數(shù)胃癌患者就診時已經(jīng)處于中晚期，錯過了最佳治療期，因而預后往往較差［3］。胃癌的發(fā)病常伴有微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的異常表達［4］，探尋特異性miRNA對胃癌的診斷和治療可能具有重要意義。miRNA是一種短鏈、非編碼RNA，可導致靶基因信使RNA（mRNA）的降解或者抑制其翻譯，在細胞分化、代謝、免疫應答等過程中起到關鍵作用［5］。據(jù)報道，miRNA在各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程扮演抑癌基因或癌基因角色，調(diào)控腫瘤細胞的多種生物學功能［6］。既往研究顯示，miR-4753-3p可能作為抑癌基因抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖，加速其凋亡［7］。miR-4753-3p在胃癌中的研究甚少，本課題組于2019年3月至2020年10月進行了miR-4753-3p相關研究，擬觀察miR-4753-3p在胃癌細胞株中的表達，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將miR-4753-3p轉(zhuǎn)入胃癌細胞，探討其對胃癌細胞的生物學性狀的影響，明確其可能的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）、胃 癌 細 胞 株（HS-746T、SGC7901、BGC823、MGC803）購于中國科學院上海細胞所；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；Transwell小室購自美國康寧公司；matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；CCK-8試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；miR-NC、miR-4753-3p mimics、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP2）基因3’-UTR熒光素酶載體（Wt-IGFBP2、Mut-IGFBP2）的構建和測序由上海吉瑪有限公司完成；實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒購于美國Thermo公司；一抗增殖細胞核抗原（PCNA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、波形蛋白（Vimentin）、IGFBP2和辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 采用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)BGC823、MGC803、GES-1細胞于37℃、5%CO2環(huán)境中，采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC7901、HS-746T細胞于37℃、5%CO2環(huán)境中。每2 d更換1次培養(yǎng)基，每3 d胰酶消化傳代。將BGC823細胞接種于6孔板，細胞密度達到30%時轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 3000試劑將miR-NC或miR-4753-3p mimics轉(zhuǎn)入胃癌BGC823細胞，分別為對照組和試驗組。驗證轉(zhuǎn)染效率后進行后續(xù)試驗。

1.3 qRT-PCR檢測miR-4753-3p和IGFBP2 mRNA的表達 按照TRIzol試劑盒說明書提取細胞株總RNA，測定純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書進行擴增，反應參數(shù)為95℃預變性10 min，95℃變性13 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照測定miR-4753-3p的相對表達，以GAPDH為內(nèi)參照測定IGFBP2 mRNA的相對表達，依據(jù)2-ΔΔCt方法計算。引物序列如下，miR-4753-3p正向引物：5’-ACACAAGGCTAAGAAAGAGA-3’，反 向 引 物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6正 向 引 物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反 向 引 物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；IGFBP2正向引物：5’-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3’，反 向 引 物5’-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3’；GAPDH正 向引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.4 CCK-8法檢測BGC823細胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染后的BGC823細胞胰酶消化，以1×103個/孔重新接種于96孔板，每組重復4個復孔，于37℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，加入10μl CCK-8試劑（濃度為5 g/L），充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標儀測定450 nm波長處每孔的吸光度（A450）值，繪制BGC823細胞的生長曲線。

1.5 Transwell侵襲試驗檢測BGC823細胞的侵襲能力 預鋪matrigel基質(zhì)膠至Transwell小室的上室內(nèi)，將轉(zhuǎn)染后的BGC823細胞胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基進行重懸，取200μl細胞懸液接種于Transwell小室的上室內(nèi)，下室加500μl RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗上室，4%多聚甲醛固定BGC823細胞，PBS溶液清洗，0.1%結(jié)晶紫染液染色。PBS溶液清洗后，在倒置顯微鏡下每組隨機選擇4個視野進行拍照和計數(shù)。

1.6 生物信息學預測miR-4753-3p的靶基因 用Deepbase v2.0預測miR-4753-3p的靶基因，IGFBP2可能是miR-4753-3p的靶基因，進一步預測miR-4753-3p與IGFBP2基因mRNA 3’-UTR可能的結(jié)合位點。

1.7 雙熒光素酶報告基因試驗驗證miR-4753-3p的靶基因 構建突變型和野生型IGFBP2基因mRNA 3’-UTR熒光素酶表達載體（Wt-IGFBP2、Mut-IGFBP2），將其和miR-NC或miR-4753-3p mimics轉(zhuǎn)染至BGC823細胞培養(yǎng)。24 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測BGC823細胞的相對熒光素酶活性，驗證IGFBP2是否是miR-4753-3p的靶基因。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測靶基因蛋白表達 裂解轉(zhuǎn)染后的BGC823細胞，提取總蛋白并測定濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，煮沸、變性。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE），取30μg蛋白電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。用10%的脫脂牛奶封閉2 h，TBST溶液洗膜后，加入一抗IGFBP2（稀釋比為1∶2 000）、PCNA（稀釋比為1∶2 000）、Vimentin（稀釋比為1∶2 000）和GAPDH（稀釋比為1∶1 000），4℃冰箱孵育過夜。TBST溶液洗膜后，辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比為1∶10 000）室溫孵育3 h。TBST溶液洗膜后，滴加超敏電化學發(fā)光（ECL）工作液，曝光顯影，比較兩組BGC823細胞相關蛋白表達。

1.9 統(tǒng)計學分析 所有試驗均重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間行獨立樣本t檢驗，多組計量資料之間統(tǒng)計分析應用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞中miR-4753-3p的表達 如圖1，正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）和 胃 癌 細 胞 株（HS-746T、SGC7901、BGC823、MGC803）中miR-4753-3p的 表 達 分 別 為（1.00±0.03）、（0.56±0.03）、（0.77±0.05）、（0.31±0.03）和（0.65±0.04），胃癌細胞株中miR-4753-3p的表達與正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比明顯降低（P＜0.01），miR-4753-3p表達最低的胃癌細胞株是BGC823細胞（均P＜0.01），因此使用BGC823細胞株進行后續(xù)試驗。

圖1 胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞中miR-4753-3p的表達

2.2 miR-4753-3p mimics轉(zhuǎn)染效率檢測 胃癌BGC823細胞轉(zhuǎn)染miR-4753-3p mimics培養(yǎng)48 h后，對照組和 試 驗 組miR-4753-3p的 表 達 分 別 為（1.01±0.07）和（12.96±1.05），試 驗 組miR-4753-3p表 達 是 對 照 組 的7.29倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示轉(zhuǎn)染成功。

2.3 過表達miR-4753-3p抑制BGC823細胞增殖 如圖2，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-4753-3p mimics的試驗組BGC823細胞在2、3、4、5 d的吸光度A值顯著下降（均P＜0.05），提示過表達miR-4753-3p后，胃癌BGC823細胞的增殖受到明顯抑制。

圖2 過表達miR-4753-3p抑制BGC823細胞增殖

2.4 過表達miR-4753-3p抑制BGC823細胞侵襲 如圖3，對照組和試驗組BGC823細胞侵襲數(shù)分別為（107.30±10.94）個 和（43.44±8.04）個。與 對 照 組 相 比，試 驗 組BGC823細胞侵襲能力顯著降低（P＜0.01），提示過表達miR-4753-3p顯著抑制胃癌BGC823細胞侵襲能力。

圖3 過表達miR-4753-3p抑制BGC823細胞侵襲

2.5 生物信息學預測miR-4753-3p的靶基因 用Deepbase v2.0預測miR-4753-3p的靶基因，IGFBP2可能是miR-4753-3p的靶基因，miR-4753-3p與IGFBP2基因mRNA 3’-UTR可能的結(jié)合位點見圖4。

圖4 miR-4753-3p與IGFBP2基因mRNA 3’UTR互補結(jié)合位點

2.6 雙熒光素酶報告基因試驗驗證miR-4753-3p的靶基因 雙熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示（圖5），與共轉(zhuǎn)染野生型Wt-IGFBP2和miR-NC相比，共轉(zhuǎn)染野生型Wt-IGFBP2和miR-4753-3p時，BGC823細胞相對熒光素酶活性明顯被抑制（P＜0.01）；共轉(zhuǎn)染突變型Mut-IGFBP2和miR-4753-3p時，BGC823細胞相對熒光素酶活性無顯著變化，提示miR-4753-3p可與IGFBP2基因mRNA3’UTR相結(jié)合。

圖5 雙熒光素酶報告基因試驗檢測結(jié)果

2.7 miR-4753-3p靶向負調(diào)控IGFBP2 mRNA表達對照組和試驗組BGC823細胞中IGFBP2 mRNA的表達分別為（1.01±0.09）和（0.26±0.03），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示miR-4753-3p可負調(diào)控IGFBP2的表達。

2.8 IGFBP2蛋白和增殖及侵襲相關蛋白的表達Western blot結(jié)果（圖6）表明，試驗組BGC823細胞IGFBP2蛋白表達明顯下降，細胞增殖蛋白PCNA表達降低，細胞侵襲蛋白Vimentin表達降低，表明BGC823細胞增殖和侵襲能力降低。

圖6 miR-4753-3p對IGFBP2蛋白和增殖、侵襲相關蛋白表達的影響

3 討 論

miRNA影響眾多基因的表達，是細胞增殖、發(fā)育、分化、侵襲、遷移等過程的關鍵調(diào)控因子［8-9］。近年來研究表明，miRNA與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切［10-11］。Ma等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-501-5p在胃癌組織和細胞株中顯著上調(diào)，下調(diào)miR-501-5p降低胃癌細胞的增殖和遷移，溶血磷脂酸受 體 1（lysophosphatidic acid receptor 1，LPAR1）是miR-501-5p的靶基因。Lv等［13］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織和細胞株中miR-6884-5p的水平顯著降低，miR-6884-5p可顯著抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-6884-5p可直接靶向S100結(jié)合蛋白A16（S100 binding protein A16，S100A16）。miR-4753-3p屬 于miR-4753家族，miR-4753-3p可能抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖及誘導其凋亡，表現(xiàn)為抑癌基因作用［7］。miR-4753-3p在胃癌細胞中的表達及調(diào)控機制尚不清楚。通過檢測miR-4753-3p在胃癌細胞株和正常食管黏膜上皮細胞中的表達，證實胃癌細胞株中miR-4753-3p表達顯著下降，表明miR-4753-3p可能參與調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展。BGC823細胞株中miR-4753-3p表達最低，故選擇BGC823細胞株進行研究。本研究結(jié)果顯示，當BGC823細胞中過表達miR-4753-3p后，BGC823細胞的增殖和侵襲能力顯著降低，提示miR-4753-3p在胃癌中表現(xiàn)為抑癌基因作用。

miRNA主要通過不完全互補或者完全互補的方式結(jié)合靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因蛋白的翻譯［14-15］。本研究應用生物信息學預測軟件Deepbase v2.0發(fā)現(xiàn)miR-4753-3p能夠與IGFBP2相結(jié)合。IGFBP2蛋白是胰島素樣生長因子家族的重要一員，具有激活腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄因子，加速腫瘤細胞DNA的擴增［16］。研究顯示，IGFBP2在多種腫瘤如肺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌中普遍過表達，可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，與患者的不良預后密切相關［17-18］。IGFBP2在胃癌組織中過表達，其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期之間均具有相關性，IGFBP2可促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展［19］。本研究顯示，共轉(zhuǎn)染野生型Wt-IGFBP2報告載體和miR-4753-3p，可使BGC823細胞相對熒光素酶活性顯著下降，提示miR-4753-3p能夠與IGFBP2直接結(jié)合。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，過表達miR-4753-3p后，IGFBP2基因在mRNA和蛋白表達均顯著降低，表明miR-4753-3p可負調(diào)控IGFBP2基因表達。IGFBP2蛋白表達下降后，BGC823細胞增殖蛋白PCNA表達降低，BGC823細胞侵襲蛋白Vimentin表達降低，表明BGC823細胞增殖和侵襲能力均下降。

綜上所述，miR-4753-3p在胃癌細胞株中低表達，miR-4753-3p可通過與IGFBP2 mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合抑制其表達，從而降低胃癌BGC823細胞的增殖和侵襲能力。miR-4753-3p可能成為胃癌治療新的分子靶點。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。