韓欣汝 尹雁惠 王倩 于克煒 張翔

濟(jì)南市中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科 250013

腦卒中是由多種因素誘發(fā)的腦內(nèi)動(dòng)脈狹窄、閉塞或破裂，進(jìn)而造成急性腦血液循環(huán)障礙，臨床表現(xiàn)為一次性或永久性腦功能障礙，具有高發(fā)病率、病死率、致殘率和并發(fā)癥多等特點(diǎn)，是全球第二大死亡原因［1］?！吨袊X卒中防治報(bào)告（2019）》發(fā)布腦卒中是國人疾病所致壽命損失年的第1位病因。全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，我國總體腦卒中終生發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為39.3%，位居全球首位，隨著腦卒中危險(xiǎn)因素的流行，我國腦卒中疾病負(fù)擔(dān)有暴發(fā)式增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，推測(cè)2030年我國腦血管病事件發(fā)生率將較2010年升高約50%［2］。其中，缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占所有腦卒中事件的80%以上，缺血性腦卒中的發(fā)生和進(jìn)展受遺傳和環(huán)境因素相互影響，對(duì)高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、吸煙、酗酒等高危因素的適當(dāng)管理和控制，只能在一定程度上降低其發(fā)生率［3］。目前，研究遺傳變異與缺血性腦卒中易感性之間的關(guān)系，做到提前診斷、積極預(yù)防成為近年來關(guān)注的重點(diǎn)。目前，有研究顯示，亞洲人群缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因有5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）4G/5G、F5 41721G＞A，其中F5 41721G＞A亞洲人群突變率低，且此樣本中均無突變，在此不過多研究。同型半胱氨酸（Hcy）是一種含硫氨基酸，通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫基途徑代謝以避免在體內(nèi)聚集，Hcy水平升高已被證實(shí)是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素之一［4］，研究表明，MTHFR基因C677T多態(tài)性是導(dǎo)致血漿Hcy升高的主要遺傳因素。MTHFR是催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸的關(guān)鍵酶，5-甲基四氫葉酸是Hcy轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸所需的甲基供體。MTHFR C677T基因中常見的C突變T可使酶活性降低35%，5-甲基四氫葉酸水平降低10%［5］，最終導(dǎo)致血漿Hcy水平升高。一項(xiàng)meta分析表明，MTHFR TT患者發(fā)生血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著更高，TT與CC純合子的卒中優(yōu)勢(shì)比（OR）為1.26（1.14～1.40）［1］。PAI-1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，是參與調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的平衡的重要組成部分，而纖溶系統(tǒng)活性的平衡是防止血栓形成的重要保護(hù)機(jī)制［6］。PAI-1的功能包括抑制組織型纖溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的活性，阻礙纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。此外，PAI-1除了調(diào)節(jié)tPA和uPA活性外，還在代謝和血管疾病、腦損傷的進(jìn)化和中風(fēng)后的恢復(fù)中發(fā)揮著多種作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，具有4G等位基因的個(gè)體在純合子條件下PAI-1水平升高。但PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性與缺血性心腦血管疾病在不同地區(qū)、人群及種族的研究結(jié)果不一致，一直存在爭(zhēng)議［7-8］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集濟(jì)南市中心醫(yī)院2016年6月至2020年1月入院并進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)的患者，最終篩選出進(jìn)行缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因檢測(cè)的468例患者納入本研究。其中292例患者住院時(shí)有缺血性腦卒中病史，定義為卒中組，176例無腦卒中患者定義為對(duì)照組。所有研究對(duì)象為山東地區(qū)漢族人群，患者間無血緣關(guān)系，包括各年齡層和性別。缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)為急性局灶性或全局性神經(jīng)功能缺損，持續(xù)時(shí)間＞24 h，無明顯原因（血管源性原因除外），從癥狀出現(xiàn)72 h內(nèi)經(jīng)腦部計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）或磁共振成像（MRI）掃描連續(xù)證實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 記錄入組患者信息，吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病史，并測(cè)定空腹血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.2.2 基因位點(diǎn)測(cè)定 用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采集2～3 ml靜脈血，采用熒光染色原位雜交檢測(cè)法。取150μl臨床全血加入1 ml NH4Cl預(yù)處理液（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司），靜置5 min后，待液體顏色變?yōu)槌吻寮t色，室溫3 500 r/min離心5 min，離心半徑8.5 cm，棄上清液，再加入核酸純化試劑（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司），混勻后加入相應(yīng)的測(cè)序反應(yīng)通用試劑（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司），采用雙通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（TL988A，西安天隆科技有限公司）完成MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G的基因檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料（年齡、TC、TG、HDL-C、LDL-C）呈非高斯分布，以M（P25，P75）表示，采用Wilcoxon秩次檢驗(yàn)比較卒中組與對(duì)照組的臨床特征差異。采用卡方檢驗(yàn)分析基因型分布和等位基因頻率。通過多因素logistic回歸分析，在加性模型、隱性模型和顯性模型中，校正年齡、性別后，研究MTHFR C677T和PAI-1 4G/5G多態(tài)性與缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。以MTHFR C677T為例，定義加性模型，CC、CT和TT分別編碼為2、1和0，顯性模型中CC編碼為1，CT、TT編碼為0，隱性模型中TT編碼為0，CT、CC編碼為1。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線水平 共有468例患者參與此項(xiàng)研究，包括292例缺血性腦卒中患者（男181例，女111例），176例無缺血性腦卒中病史的患者（男87例，女89例），結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，性別（男性）、糖尿病史、吸煙史、飲酒史等變量均有增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)患者的基線信息

2.2 MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G多態(tài)性分布MTHFRC677T和PAI-1 4G/5G等位基因頻率在卒中組和對(duì)照組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。MTHFR C677T（CC、CT、TT）在卒中組與對(duì)照組參與者的基因分布（P＝0.010）以及等位基因頻率（C和T）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.002），卒中組患者的TT基因型（49.32%）與T等位基因（67.98%）的頻率顯著高于對(duì)照組，PAI-14G/5G（4G/4G、4G/5G、5G/5G）的遺傳分布在卒中組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.044），但等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.123）。詳見表2。

表2 兩組進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)患者M(jìn)THFRC677T與PAI-1 4G/5G的基因型分布和等位基因頻率

2.3 MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G多態(tài)性與缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性（1）MTHFR C677T基因型中，卒中組的患者中TT與對(duì)照組比較，增加了缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，校正年齡和性別后，TT基因型患者的缺血性腦卒中發(fā) 生 風(fēng) 險(xiǎn) 是CC的2.208倍（95%CI：1.149～4.243，P＝0.017）。同時(shí)采用顯性（CC比TT+CT）和隱性（TT比CT+CC）模型評(píng)估MTHFRC677T對(duì)缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的影響，其中隱性模型與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)（OR＝2.375，95%CI：1.149～4.243，P＝0.017），綜上數(shù)據(jù)說明，T等位基因增加了缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。（2）PAI-1 4G/5G基因型中，卒中組的患者中4G/5G基因型與對(duì)照組比較，增加了缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，校正年齡和性別后，4G/5G基因型患者的缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是5G/5G的1.907倍（95%CI：1.090～3.338，P＝0.024）。同時(shí)，校正年齡性別后，隱性模型（4G/5G+4G/4G比5G/5G）在卒中組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR＝1.857，95%CI：1.094～3.152，P＝0.022）。與4G/4G相比，5G/5G基因型顯著降低了缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（OR＝0.424，95%CI：0.209～0.860，P＝0.017），表明5G等位基因?qū)θ毖阅X卒中具有保護(hù)作用。詳見表3。

表3 468例進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)患者3種遺傳模型與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

2.4 MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G的基因多態(tài)性聯(lián)合與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性 數(shù)據(jù)顯示，MTHFR TT與PAI-1 4G/4G或4G/5G基因型聯(lián)合作用，發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)高于對(duì)照組，其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別是MTHFR CC與PAI-1 5G/5G基因型組合的4.946倍（95%CI：1.546～15.819，P＝0.007）和3.193倍（95%CI：1.100～9.268，P＝0.033）。詳見表4。

表4 進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)患者M(jìn)THFRC677T與PAI-1 4G/5G聯(lián)合與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

3 討 論

缺血性腦卒中的發(fā)生和進(jìn)展與腦血管危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，尋找其相關(guān)致病基因，做到提前診斷、積極預(yù)防成為近年來研究的重點(diǎn)。本研究收集山東地區(qū)患者M(jìn)THFR C677T與PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性數(shù)據(jù)及缺血性腦卒中高危致病因素，首次闡明了MTHFRC677T與PAI-1 4G/5G基因組合與山東地區(qū)人群缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，根據(jù)對(duì)兩者基因多態(tài)性的統(tǒng)計(jì)分析得出，MTHFR C677T中T等位基因和PAI-1 4G/5G的4G等位基因的存在可能增加缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，MTHFR TT與PAI-1 4G/4G組缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)最高，此外，當(dāng)聯(lián)合PAI-1 4G/5G時(shí)，缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也較高。結(jié)果表明，山東地區(qū)人群中，MTHFRC677T的T等位基因與PAI-1 4G/5G的4G等位基因的可能與缺血性腦卒中易感性相關(guān)。

研究得出，MTHFRC677T的加性和隱性模型在卒中組與對(duì)照組中存在顯著性差異，與CC基因型比較，TT基因型顯著增加了山東地區(qū)人群缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。據(jù)文獻(xiàn)研究表明，MTHFRTT型變異個(gè)體需要更高的血清葉酸水平（≥15 ng/L或34 nmol/L），以克服TT變異引起的MTHFR酶缺陷［10］，對(duì)于MTHFR TT型患者可給予適當(dāng)劑量的葉酸，可提高降低tHcy的能力，同時(shí)避免過量補(bǔ)充葉酸導(dǎo)致天花板效應(yīng)和潛在不良反應(yīng)。本研究對(duì)個(gè)體葉酸水平和遺傳背景下精準(zhǔn)葉酸治療有一定的參考意義。

PAI-1 4G/5G基因4G等位基因能夠通過上調(diào)PAI-1基因表達(dá)從而引起血漿PAI-1水平升高，抑制纖溶酶的產(chǎn)生而促進(jìn)血栓形成，與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。近年來對(duì)PAI-1 4G/5G多態(tài)性與缺血性腦卒中之間的關(guān)系進(jìn)行了大量研究，但尚未達(dá)成一致結(jié)論，Tsantes等［11］收集了7 974例不同種族的數(shù)據(jù)分析得出PAI-1 4G/5G多態(tài)性與缺血性腦卒中沒有關(guān)聯(lián)。Bentley等［12］對(duì)3 336例和4 200例對(duì)照組分析顯示，與白種人的4G等位基因相比，PAI-1 4G/5G的5G等位基因與缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Cao等［13］分析了中國人群中4G/4G可使缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加63.9%（與4G/5G+5G/5G基因型比較）。此次研究結(jié)果表明，4G/4G與4G/5G均可以增加山東地區(qū)人群的缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于不同研究成果可能的原因有遺傳或環(huán)境特異性，也可能與特定的卒中分型其潛在的生物機(jī)制不同有關(guān)，特定的突變或多態(tài)性可能選擇性的增加特定卒中分型的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究探討了山東地區(qū)MTHFR C677T和PAI-1 4G/5G基因多態(tài)性分布與缺血性腦卒中發(fā)病的相關(guān)性并得出個(gè)體化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，為臨床提供更為準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)數(shù)據(jù)。但是此次研究?jī)H收集山東地區(qū)人群的數(shù)據(jù)，為單中心、回顧性研究，樣本量小，能否適用于其他地區(qū)民族仍需進(jìn)一步研究，此外，PAI-1 4G/5G的5G等位基因作為缺血性腦卒中保護(hù)因素的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。