韓芳 ，包媛媛，劉項宇，張新永*，韋燈會，張浩然，田清龍

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 昭通市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 昭通 657000；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬一年生草本植物，具有廣泛的適應(yīng)性，在海拔4000 m以下，從赤道到南北緯40° 的地區(qū)均可種植（劉洋等，2014）。基于中國馬鈴薯總產(chǎn)高、單產(chǎn)低的現(xiàn)狀，在推進馬鈴薯主糧化的戰(zhàn)略背景下（羅善軍等，2018），其種植面積不斷擴大。但隨之而出現(xiàn)了連作導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡、環(huán)境惡化、病害增多等問題。昭通市常年種植馬鈴薯面積在20×104hm2左右，是中國馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)之一。蕎麥（Fagopyrum esculentum）面積3.5×104hm2左右，赤小豆（Vigna umbellata）也是該市的重要作物，在當(dāng)?shù)胤N植面積較大。隨著馬鈴薯栽培面積不斷增加，部分地區(qū)連作已不可避免，這3種作物之間的輪作在生產(chǎn)上也時有發(fā)生。輪作可改善作物殘茬、控制病害及土壤侵蝕，使產(chǎn)量及經(jīng)濟效益得到提高。作物連作所造成的負(fù)面影響在很大程度上與土壤微生物環(huán)境有關(guān)（Roy et al.，1994），但可通過選擇種植制度和輪作方式來調(diào)控土壤微生物，進而改善土壤肥力（Bucher et al.，2005；Li et al.，2015）。土壤微生物是影響作物生長環(huán)境的主要原因之一，對植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。微生物不僅能固定和分解有機質(zhì)，使其成為土壤的有效養(yǎng)分，參與養(yǎng)分循環(huán)和植被利用過程，而且對土壤中某些無機物起到固定和維持作用，是土壤肥力變化的主要指標(biāo)之一（何志剛等，2015）。真菌在土壤中的數(shù)量僅次于細(xì)菌和放線菌，參與土壤有機質(zhì)的合成與分解，影響著土壤的一系列生化過程（Yanardag et al.，2017），作為指示土壤質(zhì)量變化的因子，可作為評價土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能與結(jié)構(gòu)的指標(biāo)（王娜等，2019）。Bunemann et al.（2014）研究發(fā)現(xiàn)，輪作效應(yīng)對土壤微生物區(qū)系的影響遠(yuǎn)大于磷肥，豬屎豆-玉米輪作顯著提高了真菌和細(xì)菌的豐度。輪作對土壤細(xì)菌和酶沒有明顯的影響，主要是對真菌數(shù)量有影響（Zhang et al.，2014）；真菌群落活動影響了植物的生長（李發(fā)虎等，2017）；在植物病蟲害防治過程中發(fā)揮作用（Vanelsas et al.，2002）；根際土壤真菌多樣性在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡和土壤質(zhì)量方面具有重要作用（Knelman et al.，2014）。根際土壤直接受植物根系及其分泌物的影響，是土壤微生物與植物相互作用的重要場所，植物通過根系活動影響根際土壤的養(yǎng)分含量和理化性狀，并改變根際微生物群落組成和多樣性。同時，根際土壤微生物多樣性和優(yōu)勢菌屬的變化，也在一定程度上反映出土壤肥力和質(zhì)量的變化趨勢（Lynch，1990）。目前，對馬鈴薯與蕎麥、赤小豆輪作根際土壤真菌群落變化的研究鮮有報道。本試驗采用馬鈴薯、蕎麥和赤小豆進行不同順序的輪作，揭示不同種植順序?qū)ψ魑锔H土壤真菌群落數(shù)量變化的規(guī)律，為耕地的保護和馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯品種選用“云薯505”，苦蕎麥和赤小豆選用當(dāng)?shù)仄贩N“線蕎”和“紅腰豆”。

1.2 試驗地概況

試驗地點為云南省昭通市靖安鎮(zhèn)松杉村9社，海拔 2202 m，103°42′7″E，27°35′29″N。土壤類型為黃壤土類，典型黃壤土屬，山地黃壤。土壤基本理化指標(biāo)如表1所示。

表1 試驗地土壤基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physical and chemical indexes of soil in the experimental site

1.3 試驗設(shè)計

前茬作物為玉米。對土表厚度20 cm的土層進行充分混合均勻，采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置 9個小區(qū)即9個處理，每處理3個重復(fù)。小區(qū)寬5 m，長12 m，隨機安排種植馬鈴薯、蕎麥和赤小豆。2017年和2018年的3月中旬播種馬鈴薯，每0.067 hm2施用 50 kg 三元復(fù)合肥（mN?mP?mK=15?15?15），普鈣40 kg，硫酸鉀10 kg，一次性作底肥施用，雙行壟作并覆蓋地膜；4月中旬播種蕎麥和赤小豆，施肥量均與馬鈴薯一致，3種作物均在播種當(dāng)年的9月中旬收獲并對根際土壤取樣。馬鈴薯種植規(guī)格：每個小區(qū)共種10行，采用大壟雙行種植，大壟距1 m，小行距0.4 m，株距0.4 m。蕎麥：采用條播撒種，每個小區(qū)共種20行，行距0.25 m。赤小豆：每個小區(qū)共種10行，行距0.5 m，株距0.4 m。試驗進行2年，每年一季作物，每小區(qū)種植作物情況如表2所示。

表2 作物輪作種植情況Table 2 The planting situation of crop rotation

取樣：2018年9月中旬收獲，同時進行作物根際土壤的取樣，每小區(qū)采用“S”形 5點法采集 5—20 cm耕層的根際土壤，將取樣點的作物根系從土中取出后收集附著在根系上的土壤，裝入密封袋置于冰盒內(nèi)，帶回實驗室，保存在?80 ℃冰箱中用于真菌群落的測定。真菌群落測定采用真菌 ITS1區(qū)相對定量測序的方法進行，引物序列如下：Primer F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；Primer R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。

1.4 數(shù)據(jù)處理

真菌群落相對定量測定數(shù)據(jù)使用USEARCH軟件進行OUT聚類分析，使用mothur軟件進行OTU分類學(xué)分析和物種注釋統(tǒng)計，使用R繪圖進行物種總豐度柱狀圖、群落結(jié)構(gòu)柱狀圖、樣本聚類樹柱狀圖、Heatmap熱圖和PCA分析。數(shù)據(jù)差異顯著性使用SPSS 25.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪作方式真菌群落多樣性分析

土壤樣品測序結(jié)果如表3，在97%相似水平上所建立的微生物文庫，樣本覆蓋率在99%以上，說明試驗所建立的文庫能夠真實地反映土壤樣本微生物群落的 OTU組成，所反映的各樣本的微生物物種信息的置信度高，具有真實性和研究意義。

表3 不同輪作方式根際土壤真菌群落的多樣性Table 3 Diversity of fungal communities in rhizosphere soil under different rotation patterns

不同輪作方式的OUT數(shù)量、Chao1和ACE指數(shù)、Shannon和 Simpson指數(shù)皆有所差異，Chao1指數(shù)最高的是處理 F、H、A，其次為 C、D、G，最小為B、I、E。ACE指數(shù)最高的是處理F、H、A，其次為C、D、B，最小的是G、I、E。結(jié)合Chao1和ACE指數(shù)，得出處理F、H、A的真菌豐富度最高。Shannon指數(shù)最大的是處理F、A、H，其次為C、B、D，最小的是G、I、E。Simpson指數(shù)最小的是處理A、F、H，其次為B、D、C，最大的是G、I、E。結(jié)合Shannon和Simpson指數(shù)可看出，不同輪作方式，處理F、A、H的真菌多樣性指數(shù)較高，而處理E和I較低。即：9個處理中，A（赤小豆連作）、F（蕎麥-赤小豆）和 H（馬鈴薯-赤小豆）的真菌豐度和多樣性較豐富，而處理E（馬鈴薯-蕎麥）和I（蕎麥-馬鈴薯）的則較低。

2.2 不同輪作方式真菌群落組成結(jié)構(gòu)分析

實驗結(jié)果如圖1所示。共檢測出10個真菌門類，分別是Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）、Mortierellomycota（被孢霉門）、Glomeromycota（球囊菌門）、Chytridiomycota（壺菌門）、Kickxellomycota（梳霉門）、Cercozoa（曳尾蟲門）、Rozellomycota（羅茲菌門）、Olpidiomycota（油壺菌門）、Calcarisporiellomycota。各處理所含真菌門相似， Ascomycota所占比例在12.4%—56.8%之間，Basidiomycota占比8.4%—28.0%，Mortierellomycota占比5.3%—18.1%。各處理間的Ascomycota百分占比為 G>D>B>F>C>A>H>I>E，處理 G、D、B的Ascomycota含量顯著高于其他處理，而含量最低的是處理I和E。Basidiomycota的百分占比為B>I>H>E>A>G>C>F>D。各處理的Mortierellomycota百分占比為C>D>G>F>A>B>H>I>E。

圖1 不同輪作方式土壤真菌門水平群落組成及相對豐度Fig. 1 Composition and relative abundance of soil fungal phylum under different rotation patterns

Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）和Mortierellomycota（被孢霉門）在所有處理中占比最高；含量最豐富的是處理 B（馬鈴薯連作）、D（赤小豆-馬鈴薯）和G（赤小豆-蕎麥），最低的是處理E（馬鈴薯-蕎麥）和I（蕎麥-馬鈴薯）；馬鈴薯連作在真菌門水平上的豐度高于赤小豆和蕎麥的連作，而馬鈴薯和蕎麥輪作的真菌豐度最低。

如圖2所示，真菌屬水平共檢測出32種真菌屬，不同處理在屬水平上主要有Mortierella（被孢霉屬）、Metacordyceps、Acremonium（頂孢霉屬）、Saitozyma、Plectosphaerella（癬囊腔菌屬）、Trechispora（糙孢菌屬）、Vishniacozyma（維希尼克氏酵母菌屬）、Spirosphaera（球旋霉屬）、Boeremia、Fusarium（鐮孢菌屬）、Isaria（棒束孢屬）、Cladophialophora（瓶霉屬）、Clitopilus（陡蓋菌屬），所占比例均在1.22%—18.05%范圍內(nèi)，其余真菌屬所占比例較低。通過真菌群落豐度比例可知，處理A的主要優(yōu)勢屬的相對豐度為：Mortierella 8.78%、Metacordyceps 6.52%、Fusarium 3.75%；處理B的優(yōu)勢屬的相對豐度為：Mortierella 7.69%、Trechispora 5.31%、Acremonium 3.27%；處理C的優(yōu)勢屬的相對豐度為 Mortierella 16.43%、Trechispora 4.77%、Clitopilus 2.57%。而Mortierella（被孢霉屬）是 3種作物連作的優(yōu)勢屬，其余真菌屬根據(jù)作物不同有較大差異。

圖2 不同輪作方式土壤真菌屬水平群落組成及相對豐度Fig. 2 Composition and relative abundance of soil fungal genus under different rotation patterns

兩種相同作物，因種植順序不同，對真菌優(yōu)勢屬的影響也不同。馬鈴薯和赤小豆輪作：處理D（赤小豆-馬鈴薯）優(yōu)勢屬的相對豐度為 Mortierella 18.05%、Boeremia 6.42%、Fusarium 4.67%；處理H（馬鈴薯-赤小豆）的優(yōu)勢屬的相對豐度為Saitozyma 6.31%、Mortierella 5.27%、Metacordyceps 3.17%；馬鈴薯和蕎麥輪作：處理E（馬鈴薯-蕎麥）優(yōu)勢屬的相對豐度為 Saitozyma 12.28%、Vishniacozyma 4.72%、Plectosphaerella 2.48%；處理I（蕎麥-馬鈴薯）的優(yōu)勢屬的相對豐度為 Saitozyma 16.08%、Plectosphaerella 8.38%、Vishniacozyma 5.87%。蕎麥和赤小豆輪作：處理F（蕎麥-赤小豆）的優(yōu)勢屬的相對豐度為 Mortierella 11.14%、Vishniacozyma 3.17%、Plectosphaerella 2.32%；處理 G（赤小豆-蕎麥）的優(yōu)勢屬的相對豐度為Mortierella 11.56%、Trechispora 7.79%、Plectosphaerella 3.64%。

由此可見，不同的輪作方式對作物根際土壤真菌群落優(yōu)勢屬的種類和豐度存在不同程度的影響，在9個處理中，連作真菌屬多樣性明顯高于輪作的處理，馬鈴薯和蕎麥的種植順序?qū)?yōu)勢屬的種類和豐度影響較小，處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理I（蕎麥-馬鈴薯）的真菌屬水平多樣性相對其他處理較低。而馬鈴薯和赤小豆的種植順序?qū)?yōu)勢屬的種類和豐度影響較大，其次是蕎麥和赤小豆。

2.3 不同輪作方式真菌群落熱圖分析

根據(jù) OTU豐度進行聚類，將高豐度、低豐度的物種模塊聚集，通過顏色變化與相似程度來直觀反映不同樣品在屬水平上群落結(jié)構(gòu)的差異性和相似性，群落熱圖能夠較為直觀反應(yīng)不同處理樣品間真菌群落中物種組成相似性、差異性、物種聚類關(guān)系等情況。由圖3可知，處理不同，根際土壤真菌優(yōu)勢屬也不同。處理 A優(yōu)勢屬為 Mortierella、Metacordyceps和 Fusarium；處理 B優(yōu)勢屬為Mortierella、Acremonium、Metacordyceps；處理 C優(yōu)勢屬為 Mortierella、Trechispora、Clitopilus；處理 D 優(yōu)勢屬：Mortierella、Fusarium、Boeremia；處理 E優(yōu)勢屬：Saitozyma、Vishniacozyma、Plectosphaerella；處理 F優(yōu)勢屬：Mortierella、Vishniacozyma、Trechispora；處理 G 優(yōu)勢屬：Mortierella、Plectosphaerella、Trechispora；處理H優(yōu)勢屬：Saitozyma、Mortierella、Metacordyceps；處理 I優(yōu)勢屬為 Saitozyma、Plectosphaerella和Mortierella。

熱圖聚類結(jié)果（圖3）中，顏色代表物種豐度，縱向聚類表示不同物種在各處理間豐度的相似情況，兩物種間距離越近，枝長越短，說明這兩個物種在各樣品間的豐度越相似；橫向聚類表示不同處理間物種豐度的相似情況，與縱向聚類一樣，兩樣品距離越近，枝長越短，說明這兩個樣品的各物種豐度越相似。由聚類樹可知，處理B（馬鈴薯連作）和處理F（蕎麥-赤小豆）的物種豐度差異最顯著，處理B和處理D（赤小豆-馬鈴薯）、處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理 I（蕎麥-馬鈴薯）、處理 C（蕎麥連作）和處理G（赤小豆-蕎麥）、處理A（赤小豆連作）、F（蕎麥-赤小豆）和處理 H（馬鈴薯-赤小豆）之間的物種豐度較為相似。

圖3 不同輪作方式土壤真菌群落結(jié)構(gòu)屬水平的熱圖聚類Fig. 3 Thermal map clustering of soil fungal community structure at genus level in different rotation patterns

2.4 不同輪作方式對真菌群落組成的主成分分析

為了更直觀的分析不同輪作方式對土壤真菌群落的影響，繪制了PCA分析圖（圖4）。PCA分析共提取了兩個主成分PC1和PC2，二者方差累計貢獻率為62.485%，說明這兩因素是造成不同輪作方式土壤真菌群落差異的主要因素。圖中各個點代表不同的處理，點距離越近，表示真菌群落結(jié)構(gòu)越相似；點距離越遠(yuǎn)，表示真菌群落結(jié)構(gòu)差異性越大。9個處理中，處理 E（馬鈴薯-蕎麥）在主成分 1軸和2軸上與其他處理的距離都較遠(yuǎn)，其中最接近的是處理 H（馬鈴薯-赤小豆）和處理 I（蕎麥-馬鈴薯）；處理F（蕎麥-赤小豆）與其他處理在主成分1軸和2軸上都有一定距離，處理B（馬鈴薯連作）和D（赤小豆-馬鈴薯）、處理H和I在主成分1軸和2軸上距離較近。PCA分析結(jié)果表明，不同的輪作方式改變了土壤真菌群落的組成結(jié)構(gòu)，且相同的作物，種植順序不同，對真菌群落的結(jié)構(gòu)也有較大的影響。

圖4 同輪作方式土壤真菌群落結(jié)構(gòu)PCA分析Fig. 4 PCA analysis of soil fungal community structure in the same crop rotation

3 討論

土壤微生物對農(nóng)作物的生長及養(yǎng)分獲取具有重要的作用（Almario et al.，2013），其群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性是土壤生態(tài)環(huán)境的重要生物指標(biāo)（Bossio et al.，2006）。連作會降低土壤質(zhì)量，單作環(huán)境下，作物的化感物質(zhì)會影響土壤微生物群落，易形成連作障礙，不利于作物生產(chǎn)（Huang et al.，2013）。本研究結(jié)果表明，連作的真菌屬水平上多樣性高于輪作處理，這與馬春梅等（2014）的研究結(jié)果一致。連作使微生物活性不斷降低，真菌的比例明顯升高，使土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化（顧美英等，2012）；大豆連作，土壤微生物總數(shù)差異不顯著，但根際真菌相對數(shù)量較高，土壤微生物組成向真菌型轉(zhuǎn)變（孟麗娜，2008）。細(xì)菌型是土壤肥力提高標(biāo)志，真菌是土壤肥力降低的指示器（劉軍等，2012）。在本研究中，馬鈴薯、赤小豆和蕎麥對根際真菌群落結(jié)構(gòu)有不同的影響，馬鈴薯連作使真菌群落豐度和多樣性高于輪作，這與孫小花等（2019）研究結(jié)果一致。土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性受到土壤理化性質(zhì)、化學(xué)因子等多方面的影響（王曉彤等，2019）；不同作物輪作方式對真菌群落結(jié)構(gòu)變化的響應(yīng)不同，作物根系向土壤中釋放的多糖、氨基酸和酶類等化學(xué)物質(zhì)使土壤環(huán)境形成了差異，對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響（袁月等，2014）；長期的單一栽培和連作導(dǎo)致真菌群落多樣性的變化，土壤真菌多樣性隨著連作年限的增加而增加（Li et al.，2019）。本研究顯示，Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）、Mortierellomycota（被孢霉門）是 9個處理中優(yōu)勢門類，但每個處理所占比例不同，這是由于作物的改變顯著改變了土壤的物理及化學(xué)性質(zhì)進而影響了微生物的生存環(huán)境（陳桂香等，2017）。在優(yōu)勢屬水平真菌的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，輪作方式對真菌屬的影響較大，每個處理的優(yōu)勢屬及所占比例不同。劉星等（2015）研究表明，馬鈴薯連作導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)顯著改變，病原菌成為優(yōu)勢種群，比如Fusarium（鐮孢菌屬）等土傳病原真菌的數(shù)量顯著增加，容易導(dǎo)致病害發(fā)生。本研究中，處理D（赤小豆-馬鈴薯）的輪作方式鐮孢菌屬占比最高，而處理E（馬鈴薯-蕎麥）、I（蕎麥-馬鈴薯）的占比較低，說明赤小豆和馬鈴薯的輪作方式更有利于鐮孢菌屬的繁殖，而馬鈴薯和蕎麥的輪作方式在一定程度上抑制了鐮孢菌屬的繁殖，可以緩解鐮孢菌引起的馬鈴薯土傳病害，這與柴瑩等（2018）的研究結(jié)果相似。土壤微生物群落多樣性和組成，受到土壤理化性質(zhì)和不同生境的影響，在不同的生境中，根際微生物群落存在差別（丁麗等，2020）。真菌群落結(jié)構(gòu)的變化與植物生物量，真菌豐度和根際分泌物等變化有關(guān)（Shi et al.，2020）。因此，可通過不同的輪作方式定向調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，優(yōu)化土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力。

4 結(jié)論

馬鈴薯、赤小豆和蕎麥不同的輪作方式，對土壤理化指標(biāo)改善最明顯的是處理E（馬鈴薯-蕎麥）、I（蕎麥-馬鈴薯）和 H（馬鈴薯-赤小豆）；蕎麥與馬鈴薯的輪作方式優(yōu)于其他處理。真菌豐度和多樣性最高的是處理A（赤小豆連作）、F（蕎麥-赤小豆）和H（馬鈴薯-赤小豆）；最小的是處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理 I（蕎麥-馬鈴薯）。優(yōu)勢門類是Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門）和Mortierellomycota（被孢霉門）；最豐富的是處理 B（馬鈴薯連作）、D（赤小豆-馬鈴薯）和 G（赤小豆-蕎麥）；最低的是處理 E（馬鈴薯-蕎麥）和處理I（蕎麥-馬鈴薯）；馬鈴薯連作在真菌門水平上的豐度高于赤小豆和蕎麥的連作，而馬鈴薯和蕎麥的輪作方式豐度最低。不同的輪作方式對作物根際土壤真菌群落優(yōu)勢屬的種類和豐度存在不同程度的影響，在9個處理中，連作真菌屬多樣性明顯高于輪作的處理。馬鈴薯和蕎麥的種植順序?qū)?yōu)勢屬的種類和豐度影響最小，且處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理I（蕎麥-馬鈴薯）的真菌屬水平多樣性相對其他處理較低；而馬鈴薯和赤小豆的種植順序?qū)?yōu)勢屬的種類和豐度影響最大，其次是蕎麥和赤小豆。所以，選擇適宜的作物，比如蕎麥進行輪作對于馬鈴薯生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展是有利的。