姚世庭，蘆光新*，鄧曄 ，黨寧，王英成，張海娟，顏琿璘

1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心/中國科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

以氣候變暖和大氣 CO2濃度升高為主要特征的全球氣候變化，嚴(yán)重影響著生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性（牟雪潔等，2016）。青藏高原作為中國的重要生態(tài)屏障，擁有著世界上海拔最高、面積最大、類型最為獨(dú)特的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)，其生態(tài)系統(tǒng)一旦遭到破壞，恢復(fù)重建的難度非常大。鑒于青藏高原獨(dú)特的生態(tài)重要性和脆弱性，研究其高寒生態(tài)系統(tǒng)成為開展全球氣候變化響應(yīng)的重要課題，青藏高原地區(qū)由于受到過度放牧、農(nóng)業(yè)墾植等人類活動的影響，大片草地開始出現(xiàn)退化，草原土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化（斯貴才等，2015）。模擬增溫實(shí)驗(yàn)表明增溫通過改變土壤溫度和水分含量，將改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)、生物量及土壤酶活性（溫小成等，2015），對植物、土壤以及微生物群落產(chǎn)生極大的影響（樸世龍等，2002）。

土壤微生物在對氣候變化的反饋中起到了至關(guān)重要的作用，氣候的變暖顯著改變了土壤微生物的數(shù)量、豐富度和碳氮元素的轉(zhuǎn)化功能（Xue et al.，2016；Cheng et al.，2017；Yu et al.，2018）。據(jù)估計(jì)，全球土壤中存在數(shù)萬種微生物（Gans et al.，2005；劉國華等，2012）。土壤微生物包括真菌、藻類（藍(lán)藻除外）、地衣等真核生物，和細(xì)菌、藍(lán)藻、放線菌等原核生物（Jenkinson et al.，1981）。它們加速土壤有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著很重要的作用（周桔等，2007）。目前對于青藏高原土壤微生物的研究較多，但是通過模擬增溫研究青藏高原真菌變化的文獻(xiàn)很少，李欣等（2017）研究發(fā)現(xiàn)增溫有利于增加三大類群微生物數(shù)量，增幅表現(xiàn)為：細(xì)菌>放線菌>真菌。真菌在土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（Miao et al.，2016），真菌不但可以參與植物殘?bào)w的分解，推動土壤養(yǎng)分的循環(huán)（盛玉鈺等，2018），也會受到植物和土壤理化性質(zhì)的影響（Rodriguez-Blanco et al.，2015），如溫度（Mateos-Rivera et al.，2016）、水分（Watson et al.，2017）、土壤養(yǎng)分（程虎等，2017）和pH（Janczak et al.，2018）等。

高通量測序技術(shù)被廣泛用于探索各種生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落（包括細(xì)菌，古細(xì)菌和真菌）的多樣性和組成結(jié)構(gòu)（Gohl et al.，2016）。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是研究真菌最常用的測序靶點(diǎn)（Filippis et al.，2017）。ITS擴(kuò)增子測序能夠真實(shí)地反映真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性（Guo et al.，2020），目前在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等微生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛（Bergsveinson et al.，2018）。對于真菌，一些基因組區(qū)域已被用作條形碼標(biāo)記，包括小亞基（SSU）和大亞基（LSU）核糖體RNA（rRNA）基因，以及兩個非編碼內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1和ITS2）。研究表明，ITS區(qū)提供了很大的豐富性和分類學(xué)分辨率（Tedersoo et al.，2016）。核DNA的整個ITS已被提名為真菌群落的通用基因條形碼，由于其更高的擴(kuò)增和測序成功率以及更高的分類學(xué)覆蓋范圍，從而實(shí)現(xiàn)了物種級的分辨率（Schoch et al.，2012）。但是，由于整個ITS區(qū)域太長無法完整測序，因此僅針對ITS1或ITS2區(qū)域是切實(shí)可行的。本論文通過在青藏高原高寒草地采用Illumina測序技術(shù)對高寒草甸土壤真菌進(jìn)行ITS擴(kuò)增子測序，深入全面研究模擬增溫后高寒草甸真菌群落組成與多樣性變化，為今后青藏高原土壤真菌多樣性的功能研究和發(fā)展利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于青海省玉樹州稱多縣珍秦鎮(zhèn)的青海大學(xué)-清華大學(xué)三江源草地生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測定位站，地理位置為 33°24′30″N，97°18′00″E，海拔 4270 m。氣候類型屬典型大陸性高原高寒氣候，氣候寒冷，四季不分明。年降水502.30 mm，主要集中在6—9月，占全年降水量的72.57%；土壤為高寒草甸土，植被為高寒草甸，存在輕度退化。建群種為高山嵩草（Kobresia pygmaea），伴生種有青藏薹草（Carex moorcroftii）、早熟禾（Poa pratensis）、垂穗披堿草（Elymus nutans）、異針茅（Stipaaliena keng）、洽草（Koeleria cristata）等；其他雜類草有黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala）、釘柱萎陵菜（Potentilla saundersiana）、兔耳草（Lagotis ramalana）等。

模擬增溫試驗(yàn)開始于2013年7月。采用開頂式氣室增溫方法，從2013—2018年連續(xù)增溫使0—15 cm土壤溫度年均增加2.50 ℃，15—30 cm土壤溫度年均增加1.36 ℃。增溫氣室由6塊梯形聚碳酸酯板鏈接成正六邊形棱臺體，梯形板下底邊長91.4 cm，上底邊長62.6 cm，斜邊長為62.6 cm，高為61.0 cm，上底邊與斜邊的夾角為103.3°和下底邊與斜邊的夾角為76.7°，將下底邊以寬度為5.0 cm的鋁合金條固定，梯形板之間用螺絲固定。試驗(yàn)期內(nèi)將增溫氣室底部的鋁合金邊扎入土中，保證增溫小室和地面的密閉性，同時也避免冬季大風(fēng)吹移。樣地所處地點(diǎn)地勢平坦，植物群落組成相對均一。為保證試驗(yàn)樣地不受干擾和破壞，用圍欄封閉，禁止放牧活動，文中用編號F、M分別代表增溫樣地與未增溫樣地，用a、b分別代表0—15 cm土層和15—30 cm土層，F(xiàn)a代表增溫0—15 cm，F(xiàn)b代表增溫15—30 cm，Ma代表不增溫0—15 cm，Mb代表不增溫15—30 cm。

1.2 試驗(yàn)方法

微生物測定方法參考Wang et al.（2019）的研究方法，用冷凍研磨法從2 g土壤中提取微生物群落基因組DNA，并使用PowerSoil?DNA分離試劑盒（MOBIO）進(jìn)行純化。DNA質(zhì)量和濃度是根據(jù)用 NanoDrop分光光度計(jì)（Nano-100，Aosheng Instrument Co Ltd.）檢測到的260/280 nm（>1.8）和260/230 nm（>1.7）的吸光度比評估的。土壤樣品的DNA濃度在20—100 ng之間更適合PCR擴(kuò)增。但是對于GeoChip雜交和Illumina測序，使用PicoGreen分析和Qubit熒光定量法（Thermo Fisher Scientific）來定量DNA量。對于真菌的ITSrRNA基因2區(qū)用成對的通用引物gITS-7F和4R，結(jié)合自行設(shè)計(jì)的條形碼來區(qū)分樣品。Illumina Miseq測序序列在（http://mem.rcees.ac.cn: 8080）平臺進(jìn)行，使用 UPARSE刪除嵌合體并將序列分類為操作分類相似度為97%的單位（OTU），不丟棄任何單例；獲得隨機(jī)重采樣OTU表。

1.3 環(huán)境因子數(shù)據(jù)采集

1.3.1 地上植物指標(biāo)的觀測

植物調(diào)查工作在 2013—2018每年植物生長季的生長高峰期（8月上旬）進(jìn)行，在每個處理內(nèi)隨機(jī)設(shè)置1個0.5 m×0.5 m的植物調(diào)查樣方，調(diào)查內(nèi)容包括物種多度、高度、生物量。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)

全氮（Total nitrogen，TN）采用凱氏定氮法（李容榕等，2020）；全碳（Total carbon，TC）采用重鉻酸鉀容量法（鮑士丹，2000）；土壤微生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）采用熏蒸提取-儀器分析法（馬婷，2013）；土壤微生物量氮（Soil microbial biomass nitrogen，SMBN）和土壤硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen，NO3?-N）采用紫外分光光度法（苗杰等，2019）；土壤銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）采用靛酚藍(lán)比色法（李志萍等，2013）；堿解氮（Alkaline nitrogen，AN）采用堿解擴(kuò)散法（李金彥，2010）；有機(jī)質(zhì)（Organic matter，OM）采用重鉻酸鉀氧化-油浴加熱法（張旭等，2014）；土壤pH值采用電位測定法（王瑞琨，2018）。

1.3.3 土壤水分、土壤溫度、土壤電導(dǎo)率的測定

在試驗(yàn)樣地安裝 HOBO U30小型自動氣象站和基于CR1000的土壤三參數(shù)分層測量系統(tǒng)，連續(xù)觀測土壤水分、土壤溫度、土壤電導(dǎo)率等指標(biāo)（姚世庭等，2019；2020），并且在各處理小區(qū)內(nèi)，分別在地上30、15 cm，地表，地下7.5、15、22.5 cm處安置溫濕度自動記錄儀探頭（Onset公司生產(chǎn)的溫濕度測定儀）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究中使用Microsoft Excel 2010對各項(xiàng)分析測定數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算，所有測序的原始數(shù)據(jù)均于中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心鄧曄研究員課題組的Galaxy分析平臺（http://mem.rcees.ac.cn:8080）完成。采用DPS 6.55，SPSS 2.0中的方差分析、最小顯著差異法和相關(guān)性分析等方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用 Origin 8軟件進(jìn)行非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS）和主坐標(biāo)分析圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌多樣性分析

2.1.1 土壤微生物群落稀釋性曲線

利用高通量測序技術(shù)，分析高寒草地不同土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，測序剔除不合格序列，所得真菌有效序列數(shù)介于74000—134000。通過個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建稀釋性曲線（圖 1），反映測序的數(shù)據(jù)是否合理，樣品中物種是否豐富。通過真菌群落稀釋性曲線發(fā)現(xiàn)物種的豐富度（observed species）呈 Mb>Ma>Fb>Fa。

圖1 土壤樣品真菌群落的稀釋曲線Fig. 1 Dilution curve of fungal communities in soil samples

由表 1可知，土壤真菌群落 Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均呈現(xiàn)出 Mb>Fb>Ma>Fa，而 Chao1指數(shù)呈現(xiàn)Mb>Fa>Ma> Fb。說明相較于對照，增溫會使真菌群落多樣性有所降低；且增溫后真菌群落豐富度也有所降低。

表1 真菌群落Alpha多樣性指數(shù)特征Table 1 Alpha diversity index characteristics of fungal communities

2.1.2 土壤真菌群落組成

通過測序分析，土壤中真菌共檢測出6個門，繪制其物種相對豐度累加圖（圖2），發(fā)現(xiàn)在Fa、Fb、Ma、Mb中子囊菌門（Ascomycota）分別為52.6%、48.9%、47.4%、66.6%，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）分別為7.0%、14.8%、10.3%、9.4%，接合菌門（Zygomycota）分別為3.4%、14.8%、3.6%、17.2%等，無法確定到門的物種（Unclassified）分別為37.0%、20.6%、38.7%、6.7%。

圖2 真菌群落門水平相對豐度的比較Fig. 2 Comparison of relative abundance of fungal community gate levels

通過測序分析，土壤中真菌共檢測出261個屬。在屬分類水平上，將豐度占比前 20的物種進(jìn)行排序，其余物種合并成other，由物種相對豐度累加圖（圖3）可知，土壤真菌主要分布為Davidiella（8.77%—15.44%）、孢霉屬（Mortierella 2.93%—10.89%）、盤菌（Aleuria 0.03%—4.72%）、隱球菌（Cryptococcus 1.17%—3.98%）、Tetracladium（0.32%—6.05%）、光黑殼屬（Preussia 1.12%—1.91%）、絲蓋傘屬（Inocybe 0.00%—4.88%）、異莖點(diǎn)霉屬（Paraphoma 0.75%—2.07%）、赤霉菌（Gibberella 0.74%—1.63%）等，但依然有 35.01%—61.56%無法鑒定到屬水平上。發(fā)現(xiàn)Fb表現(xiàn)出在Davidiella上豐度最高，Ma表現(xiàn)出在 Thelebolus上豐度最高，Mb表現(xiàn)出在Mortierella上豐度最高。

圖3 真菌群落屬水平相對豐度的比較Fig. 3 Comparison of relative abundance of fungal community genus levels

2.1.3 不同樣品Dissimilarity test差異檢測

對 Fa、Fb、Ma、Mb等 4個不同樣品進(jìn)行Bray-Curtis相異系數(shù)和Jaccard相似系數(shù)差異檢測（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌中各組之間差異均不顯著（P>0.05）。

表2 不同樣品Dissimilarity test差異檢測Table 2 Dissimilarity test for different samples

2.1.4 非度量多維尺度分析

Bray-Curtis距離主要基于OTUs的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)比較兩個群落的組成差異。相比于 Jaccard、Bray-Curtis，其包含了OTUs豐度信息。從圖4可以看出，不同處理水平下土壤樣品真菌群落組成差異不顯著，真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。

圖4 不同處理土壤真菌的非度量多維尺度分析（NMDS）Fig. 4 Non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) of soil fungi with different treatments

2.1.5 主坐標(biāo)分析樣本群落組成

構(gòu)組成較為相似主坐標(biāo)分析（PCoA，Principal Co-ordinates Analysis），用于分析研究樣本中群落組成的相似性或差異性。圖 5中 PC1貢獻(xiàn)率為66.8%，PC2貢獻(xiàn)率為14.6%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.4%，可以反映數(shù)據(jù)主要信息。樣品點(diǎn)距離越近，微生物群落的相似性度越高，PCoA結(jié)果表明，F(xiàn)a、Fb、Ma和Mb微生物群落間的相似性都較高。

圖5 不同處理土壤真菌主坐標(biāo)分析Fig. 5 Analysis of principal coordinates of soil fungi in different treatments

2.2 真菌多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析

2.2.1 不同環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系

應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析探究15種環(huán)境因子之間存在的相關(guān)性（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：環(huán)境因子之間相關(guān)性顯著，其中銨態(tài)氮與堿解氮，全氮與微生物碳，堿解氮與土壤微生物量碳，有機(jī)質(zhì)與土壤微生物量氮，土壤微生物量碳與土壤微生物量氮，土壤溫度與土壤含水量呈極顯著正相關(guān)（P<0.001），全氮與全碳、pH，堿解氮與pH、全碳，全碳與土壤微生物量氮呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.001）。

表3 環(huán)境因子相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation between environmental factors

2.2.2 真菌多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析

微生物群落組成和分布受環(huán)境因子的影響而呈現(xiàn)出多樣性，因此微生物群落的多樣性與環(huán)境因子之間存在著一定的相關(guān)性。Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示（表 4）：Shannon指數(shù)與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、堿解氮、微生物碳、微生物量氮、物種鮮重生物量、土壤電導(dǎo)率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系，而與其他指數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系。Simpson指數(shù)與pH、全碳、高度、溫度、土壤含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與其他指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，其中與物種數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05），Chao指數(shù)與pH、全碳、高度、物種數(shù)呈正相關(guān)而與其他指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。PD指數(shù)與pH、全碳、高度呈正相關(guān)，與其他指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表4 微生物多樣性與土壤環(huán)境因子Pearson相關(guān)系數(shù)矩陣Table 4 Pearson correlation coefficient matrix of microbial diversity and soil environmental factors

采用Mantel test分析微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系（表 5），發(fā)現(xiàn)在真菌群落結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn) pH、微生物氮與真菌存在顯著相關(guān)關(guān)系（P<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為r=0.3218，r=0.2318。

表5 Partial Mantel test分析微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子Table 5 Partial Mantel test analysis of microbial community structure and soil environmental factors

3 討論

目前有關(guān)青藏高原高寒草地真菌對增溫的響應(yīng)研究很少，本文基于Illumina測序技術(shù)分析模擬增溫后不同土層土壤真菌多樣性的改變以及不同土壤環(huán)境因子與土壤真菌的相關(guān)性，為將來全球變暖研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，模擬增溫導(dǎo)致真菌群落多樣性和豐富度有所降低。本次共檢測出 6個門261個屬，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）為主要門。子囊菌門（Ascomycota）豐度最高，可達(dá) 66%，其次是擔(dān)子菌門，這與李定瑤（2014）在青藏高原多年凍土中發(fā)現(xiàn)子囊菌門和擔(dān)子菌門兩個類群為優(yōu)勢菌群的結(jié)果相似。王艷發(fā)等（2016）研究的青藏高原凍土區(qū)垂直剖面土壤子囊菌（Ascomycota）與擔(dān)子菌（Basidiomycota）組成比例為75.3%和24.7%，凍土活動層的26個克隆序列均屬于子囊菌，說明活動層土壤真菌多樣性較低，推測與活動層較高的地溫有關(guān)，這與我們研究所得增溫后真菌豐度低于對照組真菌豐度的結(jié)果不謀而合。

在非度量多維尺度分析中發(fā)現(xiàn)在 Bray-Curtis距離和jaccard距離結(jié)果上，不同處理水平下土壤樣品真菌群落組成差異不顯著，F(xiàn)和M樣品聚集在一起，說明這兩個樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)組成無顯著差異。PCoA結(jié)果表明Fa、Fb、Ma和Mb微生物群落間的相似性都較高，原因可能是模擬增溫年限不夠溫度增幅太小，或者是采集的土壤深度不夠。Partial Mantel test分析微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子時發(fā)現(xiàn) pH、微生物氮對真菌多樣性群落結(jié)構(gòu)影響顯著，這與王楠等（2020）研究發(fā)現(xiàn)土壤 pH是構(gòu)建土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動力結(jié)果一致。代表著微生物群落穩(wěn)定性的土壤真菌多樣性，在一定程度上反映著群落對生態(tài)效應(yīng)的響應(yīng)（林先貴，2010）。土壤環(huán)境對真菌生長繁殖影響很大，土壤pH、溫濕度及土壤的呼吸方式等都會給微生物生存造成不同程度的影響（馬驄毓，2017）。在相似的環(huán)境下，微生物群落的結(jié)構(gòu)由植物的類型來確定，土壤微生物多樣性的不同與受到植被的影響、土壤碳氮含量、土壤含水量、酸堿度等息息相關(guān)。微生物作為青藏高原高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的一部分，對土壤碳氮循環(huán)具有重要作用。

4 結(jié)論

通過對青藏高原高寒草地土壤微生物群落組成、多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探討了土壤環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，不同的環(huán)境因子對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的影響。結(jié)果如下：

（1）群落結(jié)構(gòu)分析和多樣性分析，發(fā)現(xiàn)Fa（增溫0—15 cm）、Fb（增溫15—30 cm）、Ma（不增溫0—15 cm）、Mb（不增溫15—30 cm）在微生物組成上差異不明顯，子囊菌門（Ascomycota），擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota），球囊菌門（Glomeromycota），壺菌門（Chytridiomycota）。子囊菌門（Ascomycota）豐度最高，最高可達(dá)66%，其次是擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。

（2）多維尺度分析及主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，F(xiàn)a、Fb、Ma、Mb群落結(jié)構(gòu)較相似。土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)表現(xiàn)為：Shannon指數(shù)Mb>Fb>Ma>Fa；Simpson指數(shù) Mb>Fb>Ma>Fa；Chao1指數(shù)Mb>Fa>Ma>Fb。

（3）微生物與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果表明，pH、微生物氮是真菌群落結(jié)構(gòu)中的主要影響因子。