李欣燃 王緒英 許子怡 潘永淇 翁貴英

(六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553000)

紅車(chē)軸草，又名紅花車(chē)軸草、紅三葉，為豆科蝶形花亞科車(chē)軸草族車(chē)軸草屬(Trifolium)多年生草本植物[1-2]，含有異黃酮、維生素、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和豆香素等成分[3-4]，具有抑菌[5]、抗癌[6]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[7]、改善動(dòng)脈血管柔性[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]、神經(jīng)保護(hù)作用[10]以及調(diào)節(jié)雌激素樣作用[11]等多種生物活性。研究表明，紅車(chē)軸草可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB和NRF2信號(hào)通路[12]、參與調(diào)控抗氧化作用基因表達(dá)[13]、清除血液中的過(guò)氧化氫酶、提高血液中超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性[14]等多種方式發(fā)揮抗氧化活性；還可以激活機(jī)體免疫反應(yīng)，顯著提高血清中IgG和IgM含量[15]，使免疫細(xì)胞因子濃度增加[16]；同時(shí)促進(jìn)不飽和脂肪酸的攝入[17-18]。

在國(guó)外，紅車(chē)軸草是一種非常受歡迎的食品，其浸膏已被用于軟飲料、冰制品、糖果、焙烤食品及三葉草型香精配方等方面，以其為原料的保健食品也已進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)[19]。而在中國(guó)，盡管紅車(chē)軸草資源豐富，卻較少被利用。植物多酚對(duì)人體健康具有重要作用[20-21]，而紅車(chē)軸草中含有豐富的多酚類(lèi)化合物，是其發(fā)揮生物活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前已有關(guān)于紅車(chē)軸草內(nèi)多酚鑒定的相關(guān)研究[22-23]，而有關(guān)紅車(chē)軸草多酚提取及抗氧化性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究擬采用響應(yīng)面法對(duì)紅車(chē)軸草多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)其對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除效率評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為紅車(chē)軸草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅車(chē)軸草：六盤(pán)水本地品種，2020年5月采于六盤(pán)水師范學(xué)院校內(nèi)；

酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸對(duì)照品、沒(méi)食子酸對(duì)照品、鄰苯三酚以及水楊酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

超聲波清洗機(jī)：SB-800DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1800型，上海菁華科技儀器有限公司；

電子分析天平：ATY124型，沈陽(yáng)龍騰電子標(biāo)量?jī)x器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：BGZ-30型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理 取洗凈的紅車(chē)軸草莖、葉、花，烘干粉碎，過(guò)40目篩，備用。

1.3.2 多酚類(lèi)化合物測(cè)定 采用酒石酸亞鐵比色法[24]。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)方程繪制 取沒(méi)食子酸0.125 g定容于250 mL蒸餾水中，得0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液備用，準(zhǔn)確吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL對(duì)照品溶液于25 mL容量瓶中，按1.3.2的方法測(cè)定540 nm處吸光度，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸擬合方程為y=14.56x+0.002(R2=0.998)。

1.3.4 多酚得率計(jì)算 按式(1)計(jì)算多酚得率。

(1)

式中：

c——多酚得率，%；

m1——提取物總多酚質(zhì)量，g；

m2——樣品干粉質(zhì)量，g。

1.3.5 紅車(chē)軸草各部位多酚含量比較 將紅車(chē)軸草各部位(莖、葉、花)分別按如下條件進(jìn)行多酚提?。毫弦罕?∶80 (g/mL)，提取時(shí)間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲功率800 W，提取溫度50 ℃，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，選取多酚含量最高的部位作為后續(xù)試驗(yàn)原料。

1.3.6 提取物單因素試驗(yàn)

(1) 料液比：固定超聲時(shí)間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，考察料液比[1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90 (g/mL)]對(duì)多酚得率的影響。

(2) 提取時(shí)間：固定料液比1∶70 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，考察提取時(shí)間(10，20，30，40，50 min)對(duì)多酚得率的影響。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定料液比1∶70 (g/mL)，超聲時(shí)間20 min，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%，30%，40%，50%，60%)對(duì)多酚得率的影響。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葉部多酚得率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化其多酚類(lèi)化合物提取工藝。

1.3.8 抗氧化性試驗(yàn) 分別以超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率為指標(biāo)，測(cè)定紅車(chē)軸草中多酚提取物的抗氧化活性。

1.3.9 方法學(xué)驗(yàn)證

(1) 重復(fù)性試驗(yàn)：按照曲面響應(yīng)法的最優(yōu)條件提取紅車(chē)軸草葉多酚，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，并檢測(cè)其吸光度。

(2) 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取紅車(chē)軸草葉同批次的多酚提取物各1 mL，分別避光放置0.0，0.5，1.0，4.0，8.0 h后，按1.3.2方法進(jìn)行檢測(cè)。

(3) 加標(biāo)回收率試驗(yàn)：參照高林曉等[25]的方法，在最優(yōu)提取條件下制備紅車(chē)軸草葉多酚提取物，取1 mL待測(cè)液至25 mL的棕色容量瓶中，再取1 mL待測(cè)液和1 mL沒(méi)食子酸對(duì)照品至25 mL棕色容量瓶中，按1.3.2的方法測(cè)定各樣品吸光度并進(jìn)一步計(jì)算其多酚含量，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 通過(guò)Design-Expert 8.0.6和Excel軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及繪圖，數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)所得。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅車(chē)軸草各部位多酚含量比較

由圖1可知，紅車(chē)軸草花、葉和莖多酚平均得率分別為1.82%，2.17%，0.25%，其葉部多酚含量顯著高于莖(P<0.01)和花(P<0.001)，故選擇紅車(chē)軸草葉部作為后續(xù)試驗(yàn)研究對(duì)象。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率的影響 由圖2可知，當(dāng)料液比<1∶70 (g/mL)時(shí)，紅車(chē)軸草葉多酚得率逐漸增加，當(dāng)料液比≥1∶70 (g/mL)時(shí)，多酚得率基本不再變化，說(shuō)明在料液比為1∶70 (g/mL)時(shí)，紅車(chē)軸草葉中多酚成分幾乎達(dá)到完全溶解。綜合考慮，選擇最佳料液比為1∶70 (g/mL)。

**表示差異顯著(P<0.01)；***表示差異極顯著(P<0.001)

圖2 料液比對(duì)紅車(chē)軸草多酚得率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率的影響 由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，多酚得率達(dá)最大，可能是此時(shí)葉部多酚類(lèi)化合物基本全部析出，且隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，溶劑內(nèi)雜質(zhì)析出增多，并與多酚類(lèi)化合物發(fā)生鍵合，導(dǎo)致其得率降低。故后續(xù)選擇最佳提取時(shí)間為20 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)紅車(chē)軸草多酚得率的影響Figure 3 Extraction time’s influence on the polyphenols’yield of Trifolium pratense Linn

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率的影響 由圖4可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，紅車(chē)軸草葉多酚得率達(dá)最大，且隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加得率反而降低。這可能是40%乙醇體積分?jǐn)?shù)與其葉部多酚類(lèi)化合物極性最為接近，根據(jù)相似相溶原理，故此濃度下，葉部多酚析出量達(dá)到最大，后續(xù)選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅車(chē)軸草多酚得率的影響

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 回歸模型建立與分析 試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅車(chē)軸草葉多酚得率對(duì)料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次線性回歸方程為：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

R=-10.233 25+0.138 4A+0.046 65B+0.340 05C+1.675×10-3AB-1.725×10-3AC+6.25×10-4BC-6.975×10-4A2-4.497 5×10-3B2-2.847 5×10-3C2。

(2)

由表3可知，回歸模型的F值為88.11，P<0.000 1，該模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.512 7，表明其與真實(shí)值之間擬合性較好。一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、AC和二次項(xiàng)B2、C2極顯著(P<0.01)，表明其對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率影響很大，一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)A2差異顯著(P<0.05)，表明其對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率影響較大。由F值可知，各因素對(duì)多酚得率影響程度依次為B(提取時(shí)間)>C(乙醇體積分?jǐn)?shù))>A(料液比)。

表3 紅車(chē)軸草響應(yīng)面結(jié)果方差分析表?

2.3.2 因素交互作用分析 由圖5可知，響應(yīng)面曲面坡度變化陡峭，說(shuō)明料液比和提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用較強(qiáng)，對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率影響較大；而提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面曲面坡度變化較陡，說(shuō)明其交互作用一般，對(duì)紅車(chē)軸草葉多酚得率影響一般。

圖5 各因素交互作用對(duì)多酚得率的影響Figure 5 Interaction effects of reaction conditions on the yield of polyphenols

2.3.3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅車(chē)軸草葉多酚的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶78.94 (g/mL)，提取時(shí)間22.55 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)38.26%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，此時(shí)多酚得率預(yù)測(cè)值為2.26%。為了操作方便，將其工藝條件修正為料液比1∶79 (g/mL)，提取時(shí)間23 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)38%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，在該條件下進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，多酚得率為2.31%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小，說(shuō)明該試驗(yàn)方法準(zhǔn)確，工藝可靠。

2.3.4 抗氧化性檢測(cè) 由圖6可知，紅車(chē)軸草葉多酚提取物對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力與維生素C的變化趨勢(shì)基本一致，但整體略低于維生素C，二者的IC50值分別為0.419，0.428 mg/mL，抗氧化能力清除率均超過(guò)50%，可認(rèn)為其葉部多酚具有較好的抗氧化性。劉寶劍[26]研究發(fā)現(xiàn)，紅車(chē)軸草黃酮提取物對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為44.06，54.57 mg/mL，說(shuō)明紅車(chē)軸草中多酚的抗氧化活性顯著高于黃酮。王曉燕[27]發(fā)現(xiàn)，紅車(chē)軸草異黃酮對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.346，0.282 mg/mL，其抗氧化活性高于試驗(yàn)中的多酚提取物，可能是因?yàn)槎喾犹崛∥镏泻兄苄猿煞?，而該成分的抗氧化活性較低[28]，使提取物整體的抗氧化活性降低。

圖6 紅車(chē)軸草葉多酚提取物和維生素C的抗氧化能力比較Figure 6 Comparison of antioxidant capacity between polyphenol extraction and vitamin C

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 經(jīng)計(jì)算，按響應(yīng)面法的最優(yōu)條件提取紅車(chē)軸草葉多酚，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較小，為1.73%，說(shuō)明該試驗(yàn)重復(fù)性較為可靠。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.3.2方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅車(chē)軸草葉多酚提取物的吸光度基本無(wú)明顯變化，其RSD為0.71%，說(shuō)明紅車(chē)軸草葉的多酚提取物在避光放置8 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.4.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 由表4可知，紅車(chē)軸草葉總多酚類(lèi)化合物的平均回收率為99.44%，RSD為1.38%，說(shuō)明該試驗(yàn)對(duì)紅車(chē)軸草多酚提取物檢測(cè)方法準(zhǔn)確。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取的方法對(duì)紅車(chē)軸草莖、葉和花中多酚類(lèi)化合物進(jìn)行提取比較，發(fā)現(xiàn)葉中多酚含量最高。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到紅車(chē)軸草葉多酚提取最佳工藝參數(shù)為料液比1∶79 (g/mL)，提取時(shí)間23 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)38%，超聲功率800 W，超聲溫度50 ℃，此條件下多酚得率為2.31%。該提取物對(duì)羥自由基及超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.419，0.428 mg/mL，可認(rèn)為其葉部多酚具有較好的抗氧化性。后續(xù)應(yīng)對(duì)多酚提取物進(jìn)行分離純化以及鑒定，同時(shí)對(duì)獲取的純化物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定或者其他生物學(xué)功能探究。