賈時(shí)榮 何 洪 安鳳平，2 曾紹校，2 宋洪波，2

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

缺鐵可導(dǎo)致缺鐵性貧血或功能障礙，在所有年齡人群中都比較普遍[1-2]。第三代補(bǔ)鐵劑是以鐵螯合物存在的新型補(bǔ)鐵劑，如多糖鐵、多肽鐵、氨基酸鐵、血紅素鐵等，具有副作用低、胃腸道刺激性小和生物利用度高的特點(diǎn)[2-3]，因此成為新型補(bǔ)鐵劑開發(fā)的重要方向。茶多糖(Tea Polysaccharides)是茶葉中一類具有生理活性的復(fù)合植物多糖，因與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，又稱為酸性糖蛋白[4]。茶多糖分子中存在大量的活性基團(tuán)如羥基和羧基，使其具有良好的金屬配位能力，易與金屬離子螯合形成穩(wěn)定的復(fù)合物[5]。近年來(lái)，有關(guān)多糖鐵的合成、表征和生物活性的研究促進(jìn)了多糖鐵在食品補(bǔ)鐵劑領(lǐng)域中的應(yīng)用[6-7]。但有關(guān)黑茶多糖鐵的制備及體外消化特性的研究尚未見報(bào)道。

多糖鐵的傳統(tǒng)制備方法為加熱法，操作簡(jiǎn)單、條件易于控制，但制備時(shí)間較長(zhǎng)，且多糖鐵的鐵結(jié)合率較低。Zhang等[8]利用DEAE纖維素-52柱層析法分離桑葚多糖得到3種多糖組分(MFP1、MFP2和MFP3)，再與FeCl3溶液于70 ℃反應(yīng)1 h制備多糖鐵螯合物。結(jié)果表明MFP1-Fe、MFP2-Fe、MFP3-Fe的鐵含量分別為2.99%，2.54%，4.90%。Wang等[9]以鮑魚性腺的硫酸化多糖(AGSP)為原料，于50 ℃水浴下與三價(jià)鐵反應(yīng)(4 h)制備AGSP-Fe。結(jié)果表明AGSP-Fe的鐵含量為8.95%，模擬胃液中鐵的釋放量為36.6%，而模擬腸液中游離鐵的含量先下降后穩(wěn)定。張喜峰等[10]采用傳統(tǒng)加熱法(70 ℃處理1 h)制備了螺旋藻多糖鐵，其鐵結(jié)合率為16.42%，在pH 6.8的人工腸液中可溶性鐵為83.64%。靜態(tài)超高壓技術(shù)具有升壓速度快，壓力傳遞均勻的特點(diǎn)[11]，能夠改變植物多糖、蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)的非共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，但不會(huì)破壞其共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)[12]，可形成更利于新物質(zhì)合成的空間構(gòu)型。目前，靜態(tài)超高壓技術(shù)已被應(yīng)用于多糖和蛋白質(zhì)等大分子的改性領(lǐng)域。種曉[13]研究了靜態(tài)超高壓處理對(duì)復(fù)合蛋白抗菌膜性能的影響，發(fā)現(xiàn)超高壓能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的解離和聚合，從而提高抗菌薄膜的機(jī)械性能。丁儉等[14]采用超高壓技術(shù)對(duì)大豆蛋白/可溶性多糖復(fù)合物進(jìn)行改性，并研究了復(fù)合物對(duì)乳液形成的影響。結(jié)果表明超高壓處理改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其與多糖分子鍵合，進(jìn)而改善復(fù)合物在油—水界面的吸附和提高乳液的穩(wěn)定性。此外，Guo 等[15-16]利用靜態(tài)超高壓技術(shù)成功制備了蓮子直鏈淀粉/脂肪酸復(fù)合物和蓮子淀粉/茶多酚復(fù)合物。然而，關(guān)于靜態(tài)超高壓制備茶多糖鐵的研究尚未見報(bào)道研究擬以從黑茶中提取的茶多糖為原料，采用靜態(tài)超高壓法制備黑茶多糖鐵，并對(duì)其制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，探究其體外模擬消化過程中的穩(wěn)定性和生物可利用性，旨在為黑茶多糖鐵的高效制備和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑茶：中茶湖南安化第一茶廠有限公司；

交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-P)、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液、胃蛋白酶(14 200 U)、胰酶(USP級(jí))：上海阿拉丁生物科技有限公司；

透析袋：3 500 U，北京索萊寶科技有限公司；

無(wú)水乙醇、Na3C6H5O7·2H2O、FeCl3·6H2O、NaOH、HCl、膽鹽：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

閃式提取儀：JHBE-20A型，上海釩幟精密設(shè)備有限公司；

靜態(tài)超高壓機(jī)：5L-HPP600 MPa型，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；

電子分析天平：BSA224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：TGL-16型，四川蜀科儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，國(guó)華電器有限公司；

pH計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1780型，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑茶多糖提取 將黑茶粉碎，過60目篩。固液比(m黑茶粉∶V溶劑)1∶55 (g/mL)，閃式提取器電壓170 V、提取時(shí)間107 s；3 500 r/min離心10 min，乙醇沉淀10 h，凈水復(fù)溶濃縮后冷凍干燥得黑茶粗多糖。取15 g粗多糖溶于300 mL水中，加入3 g PVP-P攪拌10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液重復(fù)提取3次，濃縮后于3 500 U透析袋中透析48 h，冷凍干燥得黑茶多糖。

1.3.2 黑茶多糖鐵的制備 取0.2 g黑茶多糖溶于10 mL水中，加入0.1 g檸檬酸三鈉，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH至8；再加入一定量濃度為0.89 mmol/mL的FeCl3溶液，裝入塑料袋中密封，置于靜態(tài)超高壓機(jī)內(nèi)腔中，以一定壓力處理一定時(shí)間后，7 000 r/min離心10 min；收集上清液，加入4倍體積無(wú)水乙醇，醇沉1 h，3 500 r/min離心10 min后收集沉淀；沉淀加水復(fù)溶后用3 500 U透析袋透析48 h，冷凍干燥得黑茶多糖鐵復(fù)合物(DTPIC-HP)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1) 壓力：固定處理時(shí)間20 min、糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)2∶1，考察壓力(200，300，400，500，600 MPa)對(duì)黑茶多糖鐵中鐵含量的影響。

(2) 處理時(shí)間：固定壓力400 MPa、糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)2∶1，考察處理時(shí)間(10，15，20，25，30 min)對(duì)黑茶多糖鐵中鐵含量的影響。

(3) 糖鐵比：固定壓力400 MPa、處理時(shí)間20 min，考察糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵分別為1∶2，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)對(duì)黑茶多糖鐵中鐵含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 采用Box-benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黑茶多糖鐵中鐵含量為指標(biāo)，以壓力、處理時(shí)間和糖鐵比為影響因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化黑茶多糖鐵制備工藝。

1.3.5 黑茶多糖鐵中鐵含量測(cè)定 參照Lu等[17]的方法稍作修改。取0.01 g樣品溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.6%的HCl溶液中；取1 mL待測(cè)液置于25 mL具塞試管中，依次加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的HCl和1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸羥胺溶液，室溫反應(yīng)1 h；再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的鄰菲羅啉和5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的醋酸鈉溶液，加入去離子水使溶液總體積為25 mL，室溫反應(yīng)15 min，測(cè)定510 nm處吸光值，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.008 4X-0.004 8，R2=0.999 3)計(jì)算溶液中鐵離子濃度。按式(1)計(jì)算鐵離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(1)

式中：

y——鐵離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

c——鐵離子質(zhì)量濃度，μg/mL；

v——待測(cè)液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，μg。

1.3.6 體外模擬消化

(1) 模擬胃液消化：參照Hu等[18]的方法稍作修改。將2.0 g NaCl和1.6 g胃蛋白酶溶于水中，加入8 mL HCl溶液(1 mol/L)，定容至1 000 mL，用5%的HCl調(diào)整溶液pH為2，制得模擬胃消化液。分別稱取25 mg DTPIC-HP和7.5 mg FeSO4溶于250 mL胃液中，調(diào)節(jié)pH為2，37 ℃恒溫水浴振蕩，每間隔25 min取2.5 mL消化液，并補(bǔ)足相應(yīng)體積胃液，總反應(yīng)時(shí)間為150 min。將取出的消化液7 000 r/min離心10 min，收集上清液采用鄰菲羅啉法測(cè)定，并按式(2)計(jì)算可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)

式中：

Y——可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

F1——消化液中可溶性鐵質(zhì)量濃度，mg/mL；

F2——樣品溶解于等量水中的鐵質(zhì)量濃度，mg/mL。

(2) 模擬腸液消化：參照Chen等[19]的方法稍作修改。取1.7 g KH2PO4、0.225 g NaCl、3 g膽鹽和1 g胰酶溶于500 mL水中，用0.2 mol/L NaOH調(diào)整pH為7.6，制得模擬小腸消化液。分別將樣品(25 mg DTPIC-HP和7.5 mg FeSO4)溶于250 mL胃液，置于37 ℃搖床中反應(yīng)1 h后加入50 mL模擬小腸消化液，調(diào)整pH為7.6進(jìn)行模擬小腸消化。間隔25 min取2.5 mL溶液，并補(bǔ)足相應(yīng)體積的小腸消化液，總反應(yīng)時(shí)間為150 min。將取出的消化液以7 000 r/min離心10 min，收集上清液采用鄰菲羅啉法測(cè)定可溶性鐵濃度。并按式(2)計(jì)算模擬腸液消化的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS(17.0)軟件，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，鄧肯法進(jìn)行事后檢驗(yàn)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)誤差分析，Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 壓力對(duì)鐵含量的影響 由圖1可知，壓力對(duì)DTPIC-HP中鐵含量具有顯著性影響。隨著壓力的增大，DTPIC-HP中鐵含量顯著升高，當(dāng)壓力為400 MPa時(shí)鐵含量達(dá)到最大。多糖主要通過羥基和羧基與鐵離子結(jié)合[1]。壓力越大，可為螯合反應(yīng)提供更高的能量，增大了外部干預(yù)力[12]，也使多糖的空間構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出更多的羥基和羧基，從而增強(qiáng)了多糖與鐵離子的結(jié)合。酸性多糖與金屬離子結(jié)合過程中會(huì)形成類似“蛋箱”的環(huán)形結(jié)構(gòu)，金屬離子多被大分子包圍[20]。當(dāng)制備壓力過大時(shí)，多糖可能被過度降解或“蛋箱”結(jié)構(gòu)被破壞，因此結(jié)合鐵的能力顯著降低。

圖1 壓力對(duì)DTPIC-HP中鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 1 Effects of pressure on the iron contentin DTPIC-HP

2.1.2 處理時(shí)間對(duì)鐵含量的影響 處理時(shí)間過短反應(yīng)不充分，不利于多糖與鐵離子結(jié)合。由圖2可知，當(dāng)處理時(shí)間為10～20 min時(shí)，DTPIC-HP中鐵含量隨處理時(shí)間的增加而升高；繼續(xù)增加處理時(shí)間，鐵含量顯著降低。說明充分的超高壓作用時(shí)間是茶多糖與鐵離子形成穩(wěn)定的復(fù)合物所必須的；另一方面，長(zhǎng)時(shí)間超高壓處理導(dǎo)致多糖大分子被降解或結(jié)構(gòu)被破壞[20]，限制了結(jié)合鐵離子的能力。

圖2 處理時(shí)間對(duì)DTPIC-HP中鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 2 Effects of treatment time on the iron contentin DTPIC-HP

2.1.3 糖鐵比對(duì)鐵含量的影響 由圖3可知，糖鐵比對(duì)DTPIC-HP中鐵含量亦有顯著影響。隨著三氯化鐵所占比例的增加，溶液中鐵離子濃度增大，增大了鐵離子與多糖中羥基等基團(tuán)的作用機(jī)率，因此可增大茶多糖對(duì)鐵離子的結(jié)合率。當(dāng)溶液中鐵離子濃度趨于飽和后，多糖螯合鐵離子能力亦達(dá)到極限[21]。因此繼續(xù)增加溶液中三氯化鐵的比例，DTPIC-HP中鐵含量也不再變化。

圖3 糖鐵比對(duì)DTPIC-HP中鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 3 Effects of the ratio of polysaccharide to ironon the iron content in DTPIC-HP

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黑茶多糖鐵中鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，以壓力、處理時(shí)間和糖鐵比為影響因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表2 DTPIC-HP的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由軟件可得各因素對(duì)黑茶多糖鐵中鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回歸方程為：

y=16.50+0.19A+0.24B-0.74C-0.64AB-0.39AC-0.24BC-0.79A2-0.63B2-1.30C2。

(3)

表3 模型的回歸系數(shù)和方差分析?

2.2.2 響應(yīng)面及等高線分析 由圖4可知，當(dāng)壓力從200 MPa升高至400 MPa時(shí)，鐵含量逐漸升高；繼續(xù)升高壓力鐵含量則降低。當(dāng)處理時(shí)間從10 min增加至25 min時(shí)，鐵含量顯著升高；進(jìn)一步增加處理時(shí)間鐵含量逐漸降低。壓力和處理時(shí)間接近最優(yōu)水平時(shí)鐵含量的變化速率變緩，等高線圖呈橢圓形說明壓力和處理時(shí)間的交互作用對(duì)鐵含量影響顯著(P<0.05)。

圖4 壓力和處理時(shí)間的交互作用對(duì)DTPIC-HP鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 4 Interactive effect of pressure and treatment time on the iron content in DTPIC-HP

由圖5可知，當(dāng)處理時(shí)間一定，壓力從200 MPa升高至400 MPa時(shí)，鐵含量快速增加；繼續(xù)增大壓力，鐵含量快速降低。當(dāng)糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)從1∶2升高至2∶1時(shí)，鐵含量顯著升高；進(jìn)一步增大糖鐵比時(shí)鐵含量明顯下降。糖鐵比和壓力越接近最優(yōu)水平等高線間距越大，說明鐵含量接近峰值的速率變慢；等高線圖呈橢圓狀，說明糖鐵比和壓力的交互作用顯著(P<0.05)。

圖5 壓力和糖鐵比的交互作用對(duì)DTPIC-HP鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 5 Interactive effect of pressure and the ratio of polysaccharide to iron on the iron content in DTPIC-HP

由圖6可知，在壓力不變的條件下，當(dāng)處理時(shí)間從10 min增加至25 min時(shí)，鐵含量顯著增加；進(jìn)一步增加處理時(shí)間，鐵含量降低。當(dāng)糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)從1∶2升高至2∶1時(shí)，鐵含量顯著增加；進(jìn)一步增大糖鐵比，鐵含量開始降低。由等高線圖可知，處理時(shí)間和糖鐵比具有一定交互作用，但交互作用不顯著。

圖6 處理時(shí)間和糖鐵比的交互作用對(duì)DTPIC-HP鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 6 Interactive effect of the treatment time e and the ratio of polysaccharide to ironon the iron content in DTPIC-HP

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Design-Eexpert 8.0.6軟件得到黑茶多糖鐵的最佳制備工藝為壓力424.01 MPa、處理時(shí)間21.88 min、糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)1.68∶1.00，此時(shí)鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.65%?？紤]可操作性，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為壓力425 MPa、處理時(shí)間22 min、糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)1.7∶1.0，此條件下制備的鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為(16.78±0.40)%，與預(yù)測(cè)值接近，說明優(yōu)化的超高壓制備DTPIC-HP工藝可信。有研究[22]表明，采用傳統(tǒng)加熱法(38 ℃)進(jìn)行沙參多糖與三價(jià)鐵的螯合，所需時(shí)間為3 h，鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.61%。也有研究[9]以硫酸化多糖為原料，與三價(jià)鐵在50 ℃下反應(yīng)4 h制備硫酸化多糖鐵，其鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.95%。綜上，試驗(yàn)優(yōu)化的靜態(tài)超高壓制備黑茶多糖鐵工藝具有高效、復(fù)合物中鐵結(jié)合率高的優(yōu)勢(shì)。

2.3 體外模擬消化

鐵在機(jī)體中主要的吸收部位為小腸[23]。通常口服補(bǔ)鐵劑進(jìn)入小腸前會(huì)在胃中被胃酸和酶水解，部分鐵離子被釋放，其進(jìn)入小腸后溶解度降低，很難被小腸上皮細(xì)胞吸收從而降低了生物利用度[17，24]。因此，對(duì)鐵補(bǔ)充劑在胃、腸消化液中可溶性鐵含量的評(píng)估是判斷其生物利用度的一個(gè)重要方法。

由圖7(a)可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，DTPIC-HP和FeSO4中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)均出現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為25 min時(shí)，DTPIC-HP中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.41%，F(xiàn)eSO4中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為19.27%；繼續(xù)反應(yīng)至50 min，二者可溶性鐵含量趨于最大值，其中DTPIC-HP中的鐵幾乎完全可溶，而FeSO4中可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.98%。

由圖7(b)可知，反應(yīng)初始25 min，DTPIC-HP和FeSO4中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)先快速下降后趨于平穩(wěn)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為25 min時(shí)，DTPIC-HP和FeSO4中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為81.22%，18.27%；反應(yīng)結(jié)束時(shí)，DTPIC-HP中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.82%，而FeSO4中的可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為16.78%。

圖7 DTPIC-HP和FeSO4體外模擬消化試驗(yàn)對(duì)比Figure 7 Comparison of the simulated digestion experiment in vitro for DTPIC-HP and FeSO4

綜上，經(jīng)胃、腸液消化后DTPIC-HP中的可溶性鐵含量明顯高于FeSO4中的。這是因?yàn)镕eSO4在生理pH(4.5～8.5)條件下易生成氫氧化鐵沉淀[25]，且其主要在腸液消化階段快速形成沉淀。而DTPIC-HP中僅有部分鐵在胃液中被水解，在腸液中只有少量鐵不溶解；另一方面，由于緩釋作用，使得DTPIC-HP在腸液中反應(yīng)至75 min時(shí)釋放出更多的可溶性鐵。DTPIC-HP在胃、腸液中可溶性鐵含量較高的原因可能是其分子量較高，不易被胃、腸液水解，因此具有更高的生物利用度。因此，相比傳統(tǒng)加熱法制備的多糖鐵，靜態(tài)超高壓制備的黑茶多糖鐵的生物利用率更好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，靜態(tài)超高壓可顯著增強(qiáng)黑茶多糖與鐵離子的螯合，且溶液中足夠的鐵離子濃度和充足的處理時(shí)間是黑茶多糖鐵制備所必須的條件；但是過高的壓力和過長(zhǎng)的處理時(shí)間均不利于黑茶多糖鐵的形成。各因素對(duì)黑茶多糖鐵中鐵含量影響的大小順序?yàn)樘氰F比>處理時(shí)間>壓力。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳靜態(tài)超高壓工藝條件為糖鐵比(m黑茶多糖∶m三氯化鐵)1.7∶1.0，壓力425 MPa，處理時(shí)間22 min，此時(shí)黑茶多糖鐵中鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.78%。黑茶多糖鐵在體外模擬胃、腸液消化過程中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，至消化結(jié)束可溶性鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.82%，其生物利用率明顯高于無(wú)機(jī)鐵補(bǔ)充劑FeSO4。黑茶多糖鐵在體內(nèi)的消化利用還有待進(jìn)一步研究。