辛雅萱，黎若竹，李 鑫，陳麗瓊，唐軍榮，屈亞亞，，楊琳懿，，辛培堯1a，，李云芳

（1.西南林業(yè)大學(xué) a.國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心；b.西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224；2.中國(guó)科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園綜合保護(hù)中心，云南 勐臘 666303；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.云龍縣諾鄧鎮(zhèn)果郎辦公區(qū)天池保護(hù)區(qū)管護(hù)局，云南 云龍 672700）

密碼子是信使RNA（mRNA）分子上每相鄰的三個(gè)核苷酸編成的一組，在蛋白質(zhì)合成時(shí)，代表某一種氨基酸的規(guī)律。自然界中能夠編碼20 種氨基酸的密碼子共有61 個(gè)，其中有18 種氨基酸至少有兩個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)的密碼子，這種能夠編碼同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子[1-2]。研究表明，不同物種、不同生物體中的密碼子存在不能均衡使用的情況，一些密碼子頻繁出現(xiàn)，一些密碼子極少甚至不出現(xiàn)，這一現(xiàn)象為密碼子的偏好性，使用頻率最高的密碼子則為最優(yōu)密碼子[3]。而造成密碼子使用偏好性的原因主要受堿基組成、基因表達(dá)水平、密碼子位置、基因長(zhǎng)度、環(huán)境壓力等[4-7]因素影響。密碼子的偏好性在不同物種中普遍存在，盡管表現(xiàn)的偏好性各有不同，但其對(duì)于物種在基因組水平上的研究具有重要意義。

葉綠體一般為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，其基因組大小為115～165 kb，在細(xì)胞中以多拷貝的形式存在，在基因表達(dá)過(guò)程中可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯[8]。由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、基因含量保守、分子進(jìn)化速率慢等優(yōu)勢(shì)，葉綠體基因組被廣泛應(yīng)用于探究物種進(jìn)化、物種分類及系統(tǒng)發(fā)育等研究[9-10]中。目前，關(guān)于葉綠體基因組密碼子的研究，已見(jiàn)蝴蝶蘭Phalaenopsis aphrodite[11]、陸地棉Gossypium hirsutum[12]、抽 筒 竹Gelidocalamus tessellatus[13]、金蓮花Trollius chinensis[14]等物種的相關(guān)報(bào)道。

杧果Mangifera indica為漆樹(shù)科Anacardiaceae杧果屬M(fèi)angifera的常綠喬木[15-16]，又名芒果、檬果，有“熱帶果王”之稱[17]，原產(chǎn)自北印度和馬來(lái)半島，在中國(guó)主要分布于云南、廣西、廣東、四川等地[18]。杧果作為熱帶水果，汁多味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，其果皮可以入藥，葉子和樹(shù)皮還可以作黃色染料[19]。由于杧果產(chǎn)量較高、風(fēng)味獨(dú)特、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，使其目前已成為繼葡萄、柑橙、香蕉、蘋果之后的世界第五大水果[20]。目前，關(guān)于杧果的研究主要集中在杧果近緣種的探索[21]、系統(tǒng)發(fā)育分析[22]、耐旱性研究[23]以及ISSR 反應(yīng)體系優(yōu)化[24]等，而關(guān)于其葉綠體基因組密碼子偏好性方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)分析杧果葉綠體基因組密碼子偏好性特征，揭示密碼子偏性的影響因素，找出最優(yōu)密碼子，為杧果基因組研究及其遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 杧果葉綠體基因組序列

完整的杧果葉綠體基因組下載于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（Genbank 登錄號(hào)為KY635882.1），該葉綠體基因組序列全長(zhǎng)為157 780 bp，GC 含量為37.9%，共獲得86 條編碼蛋白質(zhì)的基因序列。為了提高分析密碼子偏好性的準(zhǔn)確性，首先從86 條CDS 序列中剔除序列長(zhǎng)度過(guò)短、重復(fù)的基因序列，其次選擇以ATG 為起始密碼子，TAA、TAG、TGA 為終止密碼子的CDS 序列，最終共獲得51 條序列用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.2 方 法

1.2.1 密碼子組成分析

使用CodonW 1.4.2 軟件（http://codonw.sourceforge.net）分析篩選出51 條CDS（.fasta 格式）密碼子偏好參數(shù)，獲得各CDS 序列密碼子的出現(xiàn)次數(shù)（codon number，CN）、有效密碼子數(shù)（effective number of codons，ENC）以及同義密碼子的相對(duì)使用情況（RSCU）；通過(guò)EMBOSS 在線網(wǎng)站（http://emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）分析杧果葉綠體基因組中各個(gè)密碼子第1 位、第2 位、第3 位的GC 含量（分別為GC1、GC2、GC3）和3 位堿基的GC 平均含量（用GCall表示），最后使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行參數(shù)間的相關(guān)性分析。

1.2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析可初步判斷密碼子使用偏好性的影響因素[25]。以GC3為橫坐標(biāo)、GC12[GC12=（GC1+GC2）/2]為縱坐標(biāo)，繪制二維散點(diǎn)圖，圖中每一個(gè)散點(diǎn)都為杧果的一個(gè)基因。若圖中散點(diǎn)沿對(duì)角線集中分布，則回歸系數(shù)接近于1，GC12和GC3二者的差異基本一致，密碼子不同位置上的堿基構(gòu)成沒(méi)有明顯差異，表明該基因所受到的選擇壓力較弱，受到突變的影響較大[26]。若圖中散點(diǎn)未分布在對(duì)角線周圍，則回歸系數(shù)趨近于0，GC12和GC3的變異較大，表明該基因受到選擇的影響[27]。

1.2.3 ENC-plot 繪圖分析

有效密碼子數(shù)（ENC）是一種用于辨析密碼子偏好性的依據(jù)，其理論范圍為20～61，當(dāng)數(shù)值越靠近20 時(shí)，表明密碼子受突變的影響較大，反之表示選擇對(duì)密碼子的影響較大[28]。GC3S為編碼同一氨基酸的密碼子第3 位上的G、C 總含量。以杧果葉綠體基因組各CDS 序列中的GC3S含量為橫坐標(biāo)，有效密碼子數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制二維散點(diǎn)圖，并利用公式在散點(diǎn)圖中構(gòu)出ENC 值的期望曲線，公式為：ENC=2+GC3+29/[ GC32+(1-GC3)2]（GC3為除了蛋氨酸、色氨酸和終止密碼子外，G 和C出現(xiàn)在密碼子第3 個(gè)位置的頻率）[29]。

1.2.4 PR2-plot 分析

PR2-plot 分析又名奇偶偏好（PR2）分析，是為了探究密碼子第3 位上A、T、C、G 這4 種堿基之間的組成偏差是否對(duì)密碼子偏好性產(chǎn)生影響[30]。分別以G3/（G3+C3）和A3/（A3+T3）作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖分析，平面圖中心點(diǎn)表示堿基含量A=T，C=G（密碼子不存在偏性和突變），而從中心點(diǎn)發(fā)出的矢量表示該堿基偏移的程度和方向[31]。

1.2.5 最優(yōu)密碼子分析

為了確定杧果最優(yōu)密碼子，需對(duì)其高頻率及高表達(dá)密碼子進(jìn)行分析。選取RSCU 值高于1 的密碼子作為高頻密碼子[32]，以前期篩選出的51 條杧果CDS 序列的ENC 值為參考，將其從小到大排序，然后從最低和最高兩端各取10%的基因，建立高低表達(dá)庫(kù)（ENC 值越低則密碼子偏性越高），而ΔRSCU≥0.08（高、低兩組相減所得的RSCU值）的密碼子作為高表達(dá)密碼子[33]；最終將同時(shí)表現(xiàn)為高頻和高表達(dá)的密碼子定義為杧果葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果密碼子堿基的組成

利用CodonW1.4.2 分析杧果葉綠體基因組中篩選后的51 條CDS 序列的密碼子組成，結(jié)果如表1所示。在51 條CDS 序列中，光合作用相關(guān)基因（Photosynthesis related genes）有26 個(gè)，自我復(fù)制（Self replication）基因有17 個(gè)，其他基因（Other genes）和未知功能（Unknown function）的基因各有4 個(gè)，其中未知功能的基因分別為ycf1、ycf2、ycf3、ycf4。不同基因密碼子上的GC 含量各不相同，杧果葉綠體基因密碼子不同位置上的GC 平均含量為38.77%，其中GC1的平均含量為47.25%，GC2的平均含量為39.74%，GC3的平均含量為29.31%。由表1可以看出，不同位置上分布的GC含量并不均衡，且第3 個(gè)位置上的GC 含量明顯低于前兩個(gè)位置，表明杧果葉綠體基因組密碼子偏好使用的堿基為A 和T。ENC 的取值范圍在35.64～53.49 之間，其平均值為48.14，說(shuō)明杧果葉綠體基因組密碼子的偏好性較弱。

根據(jù)杧果葉綠體基因組密碼子3 個(gè)位置上的GC 含量、有效密碼子數(shù)和密碼子出現(xiàn)次數(shù)構(gòu)建相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，CG1與CG2為極顯著相關(guān)；GCall與GC1、GC2、GC3的相關(guān)性同樣達(dá)到極顯著水平，而CG3與CG1、CG2均不顯著相關(guān)，表明杧果葉綠體基因組密碼子的GC1和GC2堿基組成相似，與GC3的組成有一定的差別。ENC 與CG3表現(xiàn)為極顯著相關(guān)，但與CG1、CG2、GCall未達(dá)到顯著相關(guān)水平，表明杧果密碼子最后一位堿基受到的偏性影響較大。密碼子數(shù)（CN）與GC2的相關(guān)性呈顯著水平，但與其他參數(shù)無(wú)顯著或極顯著相關(guān)性。

表2 密碼子數(shù)各位置GC 含量、數(shù)量與ENC 值的相關(guān)性分析?Table 2 Correlation analysis of GC content,quantity and ENC value of different position codon numbers

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析結(jié)果（圖1）顯示，GC12的取值范圍為0.331 3～0.561 2，GC3的取值在0.210 0～0.369 4 之間，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.137，可見(jiàn)GC12和GC3這兩者的相關(guān)性并不顯著。回歸系數(shù)為0.018 9，表明GC12和GC3的相關(guān)性微弱，這與表1中關(guān)于GC1、GC2和GC3的分析結(jié)果相似，說(shuō)明密碼子第3 個(gè)位置上的堿基可能與前兩個(gè)位置上的堿基構(gòu)成不同，即杧果葉綠體基因組中GC含量非常保守。可見(jiàn)，選擇對(duì)葉綠體基因組密碼子使用的影響更大。

圖1 杧果葉綠體基因組中性繪圖分析Fig.1 Neutrality plot analysis of chloroplast genes of Mangifera indica

表1 杧果葉綠體基因組不同位置的GC 含量及ENC 值Table 1 GC content and ENC value of different positions of codon in chloroplast genome of Mangifera indica

2.3 ENC-plot 繪圖分析

ENC-plot 繪圖分析結(jié)果（圖2）顯示，部分基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍，ENC 實(shí)際值與ENC 預(yù)期值基本一致，說(shuō)明突變對(duì)這些密碼子的影響較大；同時(shí)大部分基因都離標(biāo)準(zhǔn)曲線有一定距離，表示ENC 實(shí)際值與ENC 預(yù)期值之間存在一定的區(qū)別，說(shuō)明選擇對(duì)這些密碼子的影響較大。因此，杧果葉綠體密碼子偏好性同時(shí)受到突變和選擇的影響，但更多的是受到選擇的作用。

圖2 杧果葉綠體基因的ENC-plot 分析Fig.2 ENC-plot analysis of chloroplast genes of Mangifera indica

進(jìn)一步對(duì)ENC 比值頻數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，分布在-0.05～0.05 區(qū)間的基因有20 個(gè)，即這20 個(gè)基因距ENC 預(yù)期值較近；而分布在-0.05～0.05 區(qū)間以外的基因有31 個(gè)，即多數(shù)基因與ENC 預(yù)期值之間有一定距離，說(shuō)明大部分基因ENC 預(yù)期值和ENC 實(shí)際值之間存在差異，且差異較大。因此杧果葉綠體基因組密碼子的偏好更多受選擇的影響。

表3 ENC 比值的頻數(shù)分布Table 3 Distribution of ENC ratio

2.4 PR2-plot 繪圖分析

若各密碼子堿基A、T、C和G的使用頻率相同，則PR2-plot 平面圖內(nèi)基因應(yīng)當(dāng)均勻分布，但通過(guò)圖3可見(jiàn)，平面圖內(nèi)杧果密碼子基因大部分分布在右下方，說(shuō)明密碼子最后一位堿基的使用具有偏好性，且各堿基使用頻率為T 高于A，G 高于C。因此，杧果葉綠體基因組密碼子的使用受到選擇影響的同時(shí)，還受到其他因素的影響。

圖3 杧果葉綠體基因的PR2-plot 分析Fig.3 PR2-plot analysis of chloroplast genes of Mangifera indica

2.5 同義密碼子相對(duì)使用度分析

計(jì)算51 條CDS 序列的RSCU 值，結(jié)果（表4）表明，RSCU 大于1.00 的密碼子數(shù)目為30 個(gè)，其中以U 結(jié)尾的密碼子占比為53.33%（16 個(gè)），以A 結(jié)尾的密碼子占比為43.33%（13 個(gè)），以G 結(jié)尾的密碼子僅有1 個(gè)，說(shuō)明杧果葉綠體基因組偏好的密碼子是以U 或A 結(jié)尾的密碼子，不偏好以G 或C 結(jié)尾的密碼子。

2.6 最優(yōu)密碼子的確定

根據(jù)表4的結(jié)果，共選出RSCU 值＞1 的高頻密碼子為30 個(gè)。

表4 杧果葉綠體基因同義密碼子相對(duì)使用度分析Table 4 Relative synonymous codon usage analysis of chloroplast gene in Mangifera indica

根據(jù)表5的結(jié)果，進(jìn)一步篩選出ΔRSCU ≥0.08 的高表達(dá)密碼子共有22 個(gè)，其中11 個(gè)以U結(jié)尾，5 個(gè)以A 結(jié)尾，G 和C 結(jié)尾的各有3 個(gè)。將滿足RSCU 值＞1 和ΔRSCU ≥0.08 兩者條件的密碼子確定為杧果葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，最終篩選出AGU、UUG、CUU、CAA、AUU、GUU、GAU、GAA、UGU、CCA、CGU、AGA、ACU、CAU、GCU、GCA、GGU 這17 個(gè)為最優(yōu)密碼子。其中，有11 個(gè)以U 結(jié)尾，有5 個(gè)以A 結(jié)尾，僅有1 個(gè)以G 結(jié)尾。

表5 杧果葉綠體基因組最優(yōu)密碼子分析?Table 5 Optimal codons analysis in the chloroplast genome of Mangifera indica

3 討 論

在生物體核酸和蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程中，密碼子扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種中的同義密碼子存在不能均衡使用的情況，這種現(xiàn)象是物種自身基因長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，同時(shí)也是對(duì)外界環(huán)境壓力長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果[34]。影響密碼子使用偏性的原因有很多，但一般認(rèn)為，密碼子的選擇和突變才是最主要的因素。由于密碼子第3 位上的堿基比第1、2 位上的堿基所受到的選擇壓力小，因此GC3通常作為衡量密碼子使用偏性的指標(biāo)之一[35]。

以杧果葉綠體基因組51 條CDS 序列為研究對(duì)象，對(duì)其密碼子使用中性繪圖分析。結(jié)果顯示，杧果葉綠體基因組中GC 含量非常保守，可見(jiàn)選擇可能對(duì)密碼子的使用影響更多。這與大花香水月季Rosa odorata[35]、降香黃檀Dalbergia odorifera[28]、酸棗Ziziphus jujuba[36]等植物的密碼子偏好性一致；而在王鵬良等[37]對(duì)普通油茶Camellia oleifera的中性繪圖分析中，支持密碼子是受到突變和選擇的共同作用。由此可見(jiàn)，不同植物體內(nèi)密碼子受到的影響因素各不相同。通過(guò)PR2-plot繪圖分析，結(jié)果顯示杧果密碼子不同堿基使用頻率為T 高于A，G 高于C，表明這些基因不僅受到選擇的影響，還受到其他因素的影響。這與喻鳳等[38]對(duì)紫花苜蓿Medicago sativa的葉綠體密碼子堿基使用頻率一致；而趙森等[32]對(duì)秋茄Kandelia obovata進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其密碼子上的堿基使用頻率為C＞G，T＞A，得出秋茄密碼子除了受到突變和選擇的影響以外，還有其他因素的影響；在對(duì)籽粒莧Amaranthus hypochondriacus[7]葉綠體基因組密碼子的堿基分析中同樣發(fā)現(xiàn)，其密碼子堿基使用頻率明顯不相等（A＞T，G＞C）。這說(shuō)明不同植物體內(nèi)密碼子堿基組成有一定的差異，使得密碼子偏好性的影響因素是綜合性的。進(jìn)一步通過(guò)ENCplot 繪圖分析杧果密碼子偏好性，結(jié)果顯示其密碼子同時(shí)受到突變和選擇的影響，但更多的是受到選擇的作用。而在巨桉Eucalyptus grandis[39]葉綠體基因組密碼子偏好中顯示，其密碼子偏好的形成起重要作用的為突變因素。因此，可以認(rèn)為影響植物密碼子偏好形成的因素主要為突變和選擇。

本研究將同時(shí)滿足高頻和高表達(dá)的密碼子定義為最優(yōu)密碼子，在杧果葉綠體基因組確定的17個(gè)最優(yōu)密碼子中，以U 結(jié)尾的就有11 個(gè)，以A 結(jié)尾的有5 個(gè)，可以明顯看出其密碼子多數(shù)以U 和A 結(jié)尾，這與杜梨Pyrus betulifolia[40]、葡萄Vitis vinifera[41]、乳油木Vitellaria paradoxa[42]和野生沙棗Elaeagnus angustifolia[43]等植物葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的分析結(jié)果一致。

本研究只進(jìn)行了杧果葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析，未能確定其是否與杧果屬其他物種偏好性一致。因此，下一步可對(duì)杧果屬內(nèi)其他物種進(jìn)行密碼子偏好性研究，探究其他杧果屬物種是否也同時(shí)受到突變和選擇的影響，以此來(lái)確認(rèn)同一屬間造成不同植物密碼子偏好性差異的因素是否相同。

4 結(jié) 論

1）通過(guò)研究杧果葉綠體基因組密碼子使用偏好性特征，可以發(fā)現(xiàn)杧果密碼子同時(shí)受到突變和選擇的影響，但更多的是受到選擇的作用。

2）對(duì)杧果基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，提高該基因的表達(dá)效率，可為改良杧果重要性狀奠定理論基礎(chǔ)。

3）本研究篩選出的17 個(gè)最優(yōu)密碼子揭示了杧果葉綠體基因組表達(dá)的重要信息，為今后開(kāi)展杧果分子育種奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為杧果基因組水平上的應(yīng)用和研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持。