陳保林，姜 焱，伍紅瑜，李佳陽，楊丹莉，呂俊遠，程曉明

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計，2005～2015年我國甲狀腺癌的發(fā)病率年均增加12.4%，病死率年均增加2.9%[2]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常見的甲狀腺癌，PTC伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者術(shù)后復發(fā)的高危因素[3]。因此，發(fā)掘甲狀腺癌診斷及轉(zhuǎn)移風險評估的生物標志物尤為重要。二肽基肽酶4(dipeptidyl pepdidase 4, DPP4)亦稱CD26，是一種細胞表面糖蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶S9家族，參與腫瘤細胞增殖、遷移、黏附、侵襲等過程，是促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因子[4]。本實驗擬探索PTC中DPP4的表達情況，分析其表達量變化與PTC臨床病理特征的關(guān)系，為甲狀腺癌診斷及轉(zhuǎn)移風險評估尋找可靠的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)收集甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織合計849例，比較甲狀腺癌與正常甲狀腺組織中DPP4 mRNA的表達量變化，并分析其表達水平與甲狀腺癌患者預后的關(guān)系。另選取2018年1～12月遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院存檔的73例甲狀腺標本：共納入PTC石蠟標本54例，其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例；癌旁正常石蠟標本19例。男性16例，女性57例，平均年齡(44.2±12.7)歲。所有患者均為首次行甲狀腺手術(shù)，術(shù)后病理證實為PTC。本實驗通過遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1GEPIA數(shù)據(jù)分析 在GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中檢索并分析DPP4 mRNA在甲狀腺癌及正常甲狀腺中的表達情況，以中位數(shù)為分隔界值將甲狀腺癌組織中DPP4表達量分為低表達和高表達，以疾病復發(fā)為終點事件繪制Kaplan-Meier曲線，分析DPP4表達量與患者預后的關(guān)系。

1.2.2免疫組化 免疫組化染色采用SP法，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。兔抗人DPP4抗體購自美國Abcam公司(ab187048)，SP檢測試劑盒購自索萊寶生物公司(SP0041)。DPP4陽性定位于細胞膜和細胞質(zhì)，顯色呈淡黃色至棕褐色。免疫組化結(jié)果判讀由兩位病理科醫(yī)師在雙盲情況下隨機選取5個至少含有100個細胞的高倍鏡(400×)視野，觀察陽性細胞百分數(shù)及染色強度。(1)染色強度：無陽性顯色或細胞顯色與周圍間質(zhì)無法區(qū)分者為0分；淺黃色為1分；黃色或棕黃色為2分；棕褐色為3分；(2)陽性細胞百分數(shù)：陽性細胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～75%為2分；>75%為3分。將上述兩項得分結(jié)果相乘為最終判讀：0分為陰性，≥1分為陽性，1～3分為低表達，4～6分為中表達，≥7分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用百分數(shù)(%)表示，采用χ2檢驗比較DPP4在PTC和癌旁組織中的表達差異，分析其表達水平與PTC臨床病理特征的關(guān)系，Kaplan-Meier法分析DPP4表達量與患者預后情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌中DPP4的表達GEPIA數(shù)據(jù)庫收集了512例甲狀腺癌組織及337例正常甲狀腺組織DPP4 mRNA的表達情況，在正常甲狀腺組織中DPP4 mRNA呈低表達，在甲狀腺癌組織中其表達量顯著升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1)。為進一步驗證DPP4在PTC中的表達量變化，本實驗采用免疫組化法檢測PTC及癌旁正常甲狀腺組織中DPP4蛋白表達，結(jié)果提示PTC組織中DPP4陽性率為87.0%(47/54)，癌旁正常甲狀腺組織中均未見DPP4表達(0/19)，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1，圖2)。

表1 PTC及癌旁正常甲狀腺組織中DPP4的表達

2.2 DPP4表達與PTC臨床病理特征的關(guān)系DPP4表達水平根據(jù)患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、AJCC分期等因素進行亞組分析。結(jié)果顯示，DPP4表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率顯著上升(χ2=6.116，P=0.013)；而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、AJCC分期均無關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 PTC中DPP4表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 DPP4表達對甲狀腺癌患者預后的影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是甲狀腺癌術(shù)后復發(fā)的重要因素，因此應用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析DPP4表達量與甲狀腺癌患者無瘤生存期(disease-free survival, DFS)的關(guān)系，結(jié)果提示DPP4 mRNA高表達組較低表達組患者的DFS顯著縮短(圖3)，高表達組甲狀腺癌的復發(fā)風險為低表達組的1.8倍(HR=1.8，P=0.048)。

圖3 DPP4 mRNA表達與甲狀腺癌DFS的關(guān)系

3 討論

國內(nèi)外指南均提出PTC的治療應以降低復發(fā)率、提高患者DFS為目標[5-7]。因此，精準評估甲狀腺腫瘤的惡性程度具有重要意義。DPP4能夠與多種底物和蛋白分子相互作用，使得其與腫瘤的發(fā)生過程密切相關(guān)[4]。在PTC細胞系GLAG-66和TPC-1中沉默DPP4可抑制MAPK通路，進而抑制腫瘤細胞增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]；反之，促進DPP4轉(zhuǎn)錄可激活p62/Nrf2/Keap1通路，誘導PTC細胞增殖、遷移[9]。上述研究表明，DPP4是參與PTC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子，而本實驗進一步證實DPP4在PTC組織中高表達，提示DPP4可作為診斷PTC的生物標志物。

此外，本實驗發(fā)現(xiàn)DPP4表達與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且DPP4高表達者DFS縮短、復發(fā)風險增高。研究證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是術(shù)后復發(fā)的重要危險因素，N1a患者術(shù)后復發(fā)HR為2.28～3.80，而N1b患者術(shù)后復發(fā)HR高達12.24～12.26[3,10]。上述研究提示，通過檢測DPP4在癌組織中的表達水平，有助于判斷PTC患者術(shù)后復發(fā)風險。

綜上所述，如何判斷PTC的復發(fā)風險是診治該疾病的關(guān)鍵議題。本實驗提示，DPP4在PTC中高表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復發(fā)密切相關(guān)，可作為PTC診斷及預后判斷的生物標志物。目前DPP4在甲狀腺癌領(lǐng)域的研究多為回顧性、小樣本實驗，尚需設計包含甲狀腺細針穿刺物、甲狀腺腫瘤組織樣本、血清等多種樣本及多種病理亞型的前瞻性、大樣本實驗；同時，應納入BRAF、RAS、TERT等甲狀腺癌易感基因突變狀態(tài)進行亞組分析，深入研究DPP4在PTC中的作用方式與分子機制，以“分子分型”的研究視角剖析DPP4與PTC臨床病理特征的關(guān)系，夯實DPP4在PTC診斷、預后評估、術(shù)后監(jiān)測中的臨床應用價值。