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        非小細(xì)胞肺癌中EGFR、ALK、KRAS基因突變及PD-L1表達(dá)的關(guān)系

        2021-10-12 08:15:30伍錦鳳
        關(guān)鍵詞:免疫治療基因突變腺癌

        李 潔,伍錦鳳,葉 慶,汪 靜

        隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及基因測(cè)序技術(shù)的革新,肺癌的治療已經(jīng)步入基因分子分型靶向精準(zhǔn)治療和免疫治療時(shí)代。有學(xué)者提出非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者基因突變狀態(tài)可以反映PD-L1表達(dá)水平,且與免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)療效相關(guān)。已有報(bào)道指出,NSCLC組織中PD-L1的表達(dá)模式可以隨著基因突變、癌細(xì)胞蛋白表達(dá)或腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞數(shù)量的變化而發(fā)生改變[1-4]。另有研究表明,ALK融合的肺腺癌細(xì)胞可通過HIF-1a和(或)STAT3增加PD-L1的表達(dá),為ALK融合型肺腺癌患者免疫治療提供了理論依據(jù)[5]。此外,KRAS突變可經(jīng)MEK/ERK信號(hào)通路上調(diào)PD-L1的表達(dá),提示活化的KRAS在NSCLC免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[6]。PD-L1可影響肺癌免疫治療中的多條關(guān)鍵信號(hào)通路,探討PD-L1表達(dá)水平與肺癌常見驅(qū)動(dòng)基因突變狀態(tài)的相關(guān)性,將有助于深入了解影響免疫治療的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)檢測(cè)128例NSCLC中與肺癌靶向治療相關(guān)的20個(gè)基因,并分析其相應(yīng)的臨床病理學(xué)特征,同時(shí)結(jié)合免疫組化結(jié)果分析驅(qū)動(dòng)基因突變狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)的相關(guān)性,以期更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)肺癌患者制訂靶向和免疫治療方案。

        1 材料與方法

        1.1 標(biāo)本來源收集中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院2019年9月30日~2020年9月30日收治的肺癌手術(shù)切除及活檢NSCLC組織標(biāo)本128例。所有樣本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋后保存,HE染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量均>20%。128例樣本中手術(shù)大標(biāo)本74例,支氣管鏡活檢樣本54例。其中男性71例,女性57例。年齡33~89歲,中位年齡63歲。根據(jù)WHO(2015)肺腫瘤病理分類:腺癌114例,鱗狀細(xì)胞癌11例,其他類型3例。根據(jù)2017年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期8例,Ⅱ期23例,Ⅲ期35例,Ⅳ期62例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者84例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例。初診患者112例,耐藥患者16例。吸煙患者45例,非吸煙患者83例。

        1.2 DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序使用FFPE核酸提取試劑盒(BGI)提取石蠟組織樣本DNA,主要步驟包括脫蠟、消化、吸附、洗脫等;使用EGFR/KRAS/ALK基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法,BGI)進(jìn)行靶向擴(kuò)增與文庫(kù)擴(kuò)增兩輪PCR,構(gòu)建DNA文庫(kù);使用MGISEQ-2000測(cè)序儀對(duì)構(gòu)建的DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序?qū)嶒?yàn),并使用“非小細(xì)胞肺癌突變基因分析軟件”(V1,華大生物科技)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        1.3 免疫組化使用Dako 22C3抗體和羅氏免疫組化全自動(dòng)處理系統(tǒng)進(jìn)行PD-L1免疫組化染色,由2名經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的病理科高年資醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和復(fù)核。每張切片隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野(200×),PD-L1表達(dá)主要位于細(xì)胞膜,對(duì)鏡下呈現(xiàn)部分或全部胞膜陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)數(shù)評(píng)分(TPS),TPS≥1%判定為陽(yáng)性。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料使用例數(shù)或率(%)表示,PD-L1蛋白表達(dá)及EGFR、KRAS、ALK基因突變狀態(tài)與肺腺癌臨床病理特征采用χ2檢驗(yàn),并進(jìn)行Pearson相關(guān)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 EGFR、ALK、KRAS基因突變狀態(tài)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系在NSCLC中,EGFR基因突變陽(yáng)性率為55.47%(71/128),在女性、腺癌患者中的突變率較高(P<0.05),無吸煙史患者突變率高于有吸煙史患者(P=0.065);ALK基因突變陽(yáng)性率為4.69%(6/128),均為EML4-ALK融合類型,ALK融合發(fā)生的突變率在女性患者中具有高于男性患者的趨勢(shì)(P=0.05),突變陽(yáng)性患者更易發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移(P=0.031);KRAS基因突變陽(yáng)性率為8.59%(11/128),EGFR、ALK、KRAS基因突變狀態(tài)與患者年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性(P>0.05,表1)。

        表1 EGFR、ALK、KRAS突變與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

        2.2 PD-L1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系PD-L1在肺癌細(xì)胞中呈細(xì)胞膜染色,染色強(qiáng)度分為陰性、弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性(圖1)。TPS=0占30.47%(39/128),TPS 1%~49%占41.41%(53/128),TPS≥50%占28.12%(36/128)。男性(P=0.073)、非吸煙患者(P=0.022)中PD-L1≥1%水平相對(duì)較高;其中肺腺癌(P=0.007)、Ⅲ+Ⅳ期患者PD-L1 TPS 1%~49%水平相對(duì)較高(P=0.022)。PD-L1表達(dá)與患者年齡、胸膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05,表2)。

        圖1 A.PD-L1陰性肺癌石蠟組織HE染色;B.PD-L1陰性,EnVision法;C.PD-L1弱陽(yáng)性肺癌石蠟組織HE染色;D.PD-L1弱陽(yáng)性,EnVision法;E.PD-L1強(qiáng)陽(yáng)性肺癌石蠟組織HE染色;F.PD-L1強(qiáng)陽(yáng)性,EnVision法

        表2 PD-L1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

        2.3 NSCLC中PD-L1表達(dá)與EGFR、KRAS、ALK突變的相關(guān)性KRAS突變患者PD-L1陽(yáng)性率高(P=0.022);在EGFR突變患者中PD-L1 TPS 1%~49%水平患者陽(yáng)性率較高(P=0.025),但總體陽(yáng)性率僅具有較高的趨勢(shì)(P=0.092);PD-L1表達(dá)與ALK表達(dá)無關(guān)(P>0.05,表3)。與EGFR突變患者比較,KRAS突變患者腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平較高(P=0.028),而與ALK突變型及野生型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2)。EGFR 19del/L858R及KRAS G12D/G12C各突變亞型患者之間PD-L1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2)。PD-L1表達(dá)與KRAS基因突變呈顯著正相關(guān)(r=0.203,P=0.022),與EGFR基因突變呈負(fù)相關(guān),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.149,P=0.093),與ALK基因突變無相關(guān)性(r=0.067,P>0.05,表4)。

        表3 PD-L1表達(dá)與NSCLC腫瘤分子分型的相關(guān)性

        表4 NSCLC中PD-L1表達(dá)與EGFR、ALK、KRAS基因突變狀態(tài)的相關(guān)性

        圖2 A.EGFR、ALK、KRAS突變型及野生型患者PD-L1表達(dá)水平比較;B.EGFR、KRAS突變亞型間患者PD-L1表達(dá)水平比較

        3 討論

        在NSCLC中,EGFR突變可激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的下游信號(hào)通路。既往研究表明,EGFR突變與非吸煙女性亞裔肺腺癌患者密切相關(guān)[7]。本組中,EGFR突變?cè)谂?P=0.022)、腺癌(P<0.001)中頻率較高,雖然非吸煙患者EGFR突變率高于吸煙者,但與患者吸煙史、年齡、TNM分期無相關(guān)性(P>0.05),可能由于納入研究的樣本量少,具有一定局限性。ALK融合是腫瘤最常見的活化和過表達(dá)機(jī)制,融合的主要形式是EML4-ALK,發(fā)生率占5%~6%[8]。ALK重排多見于年輕、女性、從不或輕度吸煙的晚期肺腺癌患者[9]。本組6例ALK陽(yáng)性患者融合類型均為EML4-ALK,陽(yáng)性率為4.69%,與文獻(xiàn)報(bào)道一致;融合發(fā)生率在女性、年輕、腺癌、晚期患者中較高。KRAS基因突變可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),在亞洲肺腺癌患者中約占10%,且在老年、男性、吸煙、肺黏液型腺癌中的陽(yáng)性率高[10-13]。本組中KRAS突變率為8.59%,與既往研究基本一致;在老年、男性、肺腺癌的患者中陽(yáng)性率較高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此類患者預(yù)后較差,且與EGFR-TK1耐藥密切相關(guān),因此檢測(cè)KRAS突變狀態(tài)對(duì)NSCLC治療具有重要的指導(dǎo)意義[14]。

        PD-1與PD-L1結(jié)合可抑制CD4、CD8+T細(xì)胞的增殖與活化,促進(jìn)T細(xì)胞凋亡,負(fù)性調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答過程。有研究表明,PD-L1表達(dá)水平在女性、非吸煙、腺癌患者中較高,在EGFR、KRAS突變型NSCLC細(xì)胞組中高于野生型組,使用EGFR抑制劑可以降低其在突變型組細(xì)胞中的表達(dá)水平,但對(duì)野生型組不產(chǎn)生影響[1,15-16]。本組中PD-L1表達(dá)水平在非吸煙患者中高于吸煙者(P=0.022),在男性患者中表現(xiàn)出高于女性的趨勢(shì)(P=0.073);EGFR(P=0.092)、KRAS突變患者陽(yáng)性率高(P=0.022),且在KRAS突變患者中高于EGFR突變患者(P<0.05),但與ALK突變及野生型患者組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        綜上所述,PD-L1表達(dá)與EGFR、KRAS有相關(guān)性,其表達(dá)水平在肺癌不同突變亞型之間存在差異,以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療方案有望成為EGFR、KRAS突變型患者的輔助治療手段。

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