詹瑪琍，李 恒，吳海波

室管膜瘤(ependymomas, EPN)屬于神經(jīng)上皮性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的3.1%，占顱內(nèi)膠質(zhì)腫瘤的3%～9%[1]。近年研究表明EPN的預(yù)后不僅依賴于組織學(xué)分型，還與分子基因的改變相關(guān)。如伴RELA基因融合的幕上EPN提示預(yù)后不良，而伴YAP1融合基因的EPN預(yù)后相對較好[2-3]。H3K27me3是組蛋白H3的第27個氨基酸上發(fā)生三甲基化，在彌漫性中線膠質(zhì)瘤、高級別膠質(zhì)瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤、罕見的去分化軟骨肉瘤、惡性神經(jīng)鞘膜瘤等疾病中均出現(xiàn)表達異常[4-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)部分EPN中H3K27me3表達缺失[6]，而H3K27me3蛋白表達與EPN預(yù)后關(guān)系的報道較少。本文著重探討H3K27me3蛋白在不同亞型EPN中的表達，分析其表達與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為EPN的預(yù)后提供新的評估指標(biāo)，以及為患者的個體化、精準化治療提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2019年12月中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)切除并診斷為EPN的標(biāo)本48例，其中WHO Ⅰ級4例，WHO Ⅱ級33例，WHO Ⅲ級11例，收集患者的臨床資料進行回顧性分析，并對患者進行隨訪。病理切片由兩名高年資醫(yī)師復(fù)診。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision兩步法。抗體GFAP(UMAB129)、Olig-2(EP112)和H3K27me3(RM175)均購自北京中杉金橋公司；EMA(E29)購自福州邁新公司；L1CAM (EPR23241-224)購自英國Abcam公司；C11orf95-RELA融合基因試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷GFAP、L1CAM陽性定位于細胞質(zhì)，EMA陽性定位于細胞核旁或胞質(zhì)，H3K27me3、Olig-2陽性定位于細胞核。根據(jù)陽性細胞百分比和陽性細胞著色強弱進行判斷。(1)按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)≤1%為0分，2%～10%為1分，11%～25%為2分，26%～50%為3分，>50%為4分。(2)按陽性著色強弱計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項評分相乘作為總積分：<1分為陰性，≥1分為陽性[7]。H3K27me3缺失的標(biāo)準：超過90%腫瘤細胞核染色丟失，切片內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞可以作為陽性對照[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用t檢驗和χ2檢驗或Fisher精確檢驗軟件，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理學(xué)特征本組48例EPN中，男性19例，女性29例，男女比為1 ∶1.5，發(fā)病年齡3～75歲，平均39歲。30例位于脊髓、5例位于幕上、13例位于后顱窩(表1)。WHO Ⅰ級的黏液乳頭型EPN 4例，腫瘤細胞呈放射狀圍繞在血管周圍形成乳頭狀結(jié)構(gòu)，瘤細胞間可見黏液樣背景；WHO Ⅱ級的脊髓EPN 24例、幕上EPN 1例、后顱窩EPN 8例，組織學(xué)特征為腫瘤細胞圍繞在血管周圍形成假菊形團(圖1、2)和室管膜真菊形團，少數(shù)呈乳頭狀生長；WHO Ⅲ級的脊髓間變型EPN 2例、幕上間變型EPN 4例、后顱窩間變型EPN 5例，組織學(xué)特征為腫瘤細胞圍繞血管形成放射狀假菊形團，細胞密度較高，易見核分裂象(圖3、4)。48例患者術(shù)后均接受隨訪，其中7例復(fù)發(fā)，2例死亡，該9例中4例發(fā)生于后顱窩，2例發(fā)生于幕上，3例發(fā)生于脊髓，余39例均未出現(xiàn)復(fù)發(fā)及死亡。48例EPN中45例行GFAP免疫組化檢測均為陽性(陽性率100%)；44例行Olig-2免疫組化檢測，5例陽性(少數(shù)核陽性，陽性率11%)；44例行EMA免疫組化檢測，35例核旁點狀陽性(陽性率79%)；7例EPN行L1CAM檢測，4例陽性均為幕上EPN(3例為間變型EPN，1例為WHO Ⅱ級)，其中3例L1CAM陽性病例行FISH檢測顯示均存在C11orf95-RELA融合基因陽性。隨訪顯示4例L1CAM陽性病例中有1例患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。

WHO分級、H3K27me3表達在后顱窩、脊髓、幕上EPN中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。后顱窩及幕上EPN的發(fā)病年齡均較脊髓EPN年輕，前兩者與脊髓對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 不同部位EPN的臨床病理特征[n(%)]

2.2 EPN中H3K27me3表達及與預(yù)后的關(guān)系在48例EPN中，H3K27me3僅在5例后顱窩EPN中表達缺失(圖5、6)，其中3例為WHO Ⅲ級，2例為WHO Ⅱ級。5例H3K27me3表達缺失病例中有4例隨訪顯示復(fù)發(fā)或死亡。生存分析顯示，H3K27me3表達缺失患者與未缺失患者的無進展生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖7)，而總生存期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖8)。

圖7 H3K27me3表達與患者無進展生存期的關(guān)系

圖8 H3K27me3表達與患者總生存期的關(guān)系

3 討論

3.1 EPN臨床病理特征及分子遺傳學(xué)特征研究表明組蛋白修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。組蛋白可以通過共價修飾(如乙?；?、甲基化、磷酸化)控制染色質(zhì)的活性或失活程度，參與多種腫瘤的發(fā)生。H3K27me3是組蛋白H3的甲基化產(chǎn)物，是一種抑制基因轉(zhuǎn)錄的蛋白標(biāo)記，在調(diào)控細胞增生及分化中起重要作用。Ngollo等[9]研究表明H3K27me3是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的新生物學(xué)標(biāo)志物。H3K27me3表達缺失是由于突變型組蛋白H3通過與EZH2亞基(PRC2重要組成酶)結(jié)合，使PRC2(多梳抑制復(fù)合物2)沉默轉(zhuǎn)錄驅(qū)動基因，驅(qū)動基因無法被激活。H3K27me3表達缺失見于多種腫瘤，如惡性周圍神經(jīng)鞘膜瘤、Merkel細胞癌[10]、腦膜瘤、去分化軟骨肉瘤等，其與腫瘤更高的組織學(xué)分級、增殖活性和更短的生存期相關(guān)[11]，如H3K27me3表達缺失與Ⅰ/Ⅱ型腦膜瘤和彌漫性中線膠質(zhì)瘤預(yù)后不良密切相關(guān)[12]。2016年Gessi等[13]首次報道在EPN中H3K27me3蛋白表達缺失。目前少量報道顯示H3K27me3表達缺失的EPN預(yù)后不佳。本實驗全面觀察H3K27me3在脊髓、幕上和后顱窩EPN中的表達情況，發(fā)現(xiàn)H3K27me3表達缺失均發(fā)生于后顱窩EPN，幕上和脊髓EPN均未出現(xiàn)表達缺失(P<0.05)。13例后顱窩EPN中有5例H3K27me3表達缺失，且5例表達缺失后顱窩EPN中有4例患者預(yù)后不佳(1例死亡、3例復(fù)發(fā))，與Bayliss等[6]報道相似。本實驗進一步證實H3K27me3可以作為判斷后顱窩EPN預(yù)后的生物標(biāo)志物。

臨床發(fā)現(xiàn)部分EPN分級與患者預(yù)后之間的相關(guān)性較差，隨著近年來對腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的深入，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類分子信息及實踐方法聯(lián)盟(cIMPACT)工作委員會提出了一種依據(jù)EPN分子特征、解剖部位以及表觀遺傳學(xué)特征等不同改變的綜合分型方法，將EPN分為9個不同的分子亞型，分別位于脊柱、后顱窩、幕上[14]。成人EPN好發(fā)于脊柱，而約90%的兒童EPN發(fā)生于顱內(nèi)。本組結(jié)果顯示，脊髓EPN患者平均發(fā)病年齡48歲，幕上和后顱窩EPN患者平均年齡分別為18、24歲，脊髓EPN平均發(fā)病年齡明顯高于幕上和后顱窩EPN(P<0.05)，與文獻報道的年齡趨勢相符[14]。目前認為，部分脊髓EPN的發(fā)病機制與NF2突變有關(guān)，該部分EPN的總生存率較好。黏液乳頭型EPN好發(fā)于成人，目前黏液乳頭型EPN與成人EPN的臨床預(yù)后相似，腫瘤細胞可通過腦脊液播散到其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位或經(jīng)血液轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)外部位，甚至在疾病的早期就可發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[15]。因此，cIMPACT提出黏液乳頭型EPN應(yīng)歸為WHO Ⅱ級。本組4例脊髓黏液乳頭型EPN患者均未發(fā)生復(fù)發(fā)或死亡。近年有學(xué)者提出伴MYCN基因擴增的脊髓EPN，其特征為具有侵襲性、早期播散、間變形態(tài)和MYCN基因擴增，預(yù)后較差[16]。幕上EPN主要有C11orf95-RELA和YAP1-MAMLD1融合基因，前者好發(fā)于兒童及年輕人[17]，一般預(yù)后較差。本組3例RELA融合基因陽性患者，發(fā)病年齡3～14歲，其中1例患者復(fù)發(fā)。幕上EPN也可存在其他融合基因，如C11orf95與MAML2、YAP1,YAP1與FAM118B。后顱窩EPN根據(jù)基因表達圖譜和CpG島(CpGi)甲基化狀態(tài)分為后顱窩室管膜瘤A型(posterior fossa ependymomas group-A, EPN-PFA)和后顱窩室管膜瘤B型(posterior fossa ependymomas group-B, EPN-PFB)。EPN-PFA型主要發(fā)生于兒童，基因表達譜明顯，表現(xiàn)為CpGi高甲基化，侵襲性較強，大多數(shù)研究結(jié)果顯示預(yù)后較差。EPN-PFB型發(fā)生在老人和年輕人，表現(xiàn)為廣泛染色體畸變，侵襲性較小，預(yù)后較好[12-13]。Bayliss等[6]等發(fā)現(xiàn)，基因組H3K27me3表達與CpGi甲基化呈反向關(guān)系，提示CpGi高甲基化導(dǎo)致后顱窩EPN中H3K27me3水平較低。另有研究提出通過H3K27me3免疫染色將后顱窩EPN分為H3K27me3陰性組和H3K27me3陽性組，分別對應(yīng)于EPN-PFA型和EPN-PFB型。本組13例后顱EPN中5例H3K27me3表達缺失。5例表達缺失組中有1例死亡、3例復(fù)發(fā)，而8例未缺失組均未出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果表明，H3K27me3缺失EPN的臨床特征與EPN-PFA型相似，提示H3K27me3表達缺失EPN可對應(yīng)分子分型EPN-PFA型，進一步說明H3K27me3可作為后顱窩EPN分型及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。文獻報道，H3K27me3表達缺失患者與H3K27me3表達未缺失患者的總生存期及無進展生存期差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[18]。本組生存分析發(fā)現(xiàn)，H3K27me3表達缺失患者的無進展生存期及總生存期低于H3K27me3未缺失患者，且H3K27me3可作為預(yù)后因素預(yù)測后顱窩EPN的無進展生存期，而兩者的總生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本組結(jié)果與已知報道存在部分差異，可能與本組統(tǒng)計樣本量較少有關(guān)，待后續(xù)收集更多病例進一步分析。

3.2 治療目前，對EPN的治療是基于病理分型分級，所有級別和類型的治療都包括最大程度的手術(shù)切除，經(jīng)影像學(xué)證實完整切除的WHO Ⅱ級EPN患者術(shù)后可以密切隨訪，但WHO Ⅲ級和Ⅱ級次全切除的EPN需行輔助放療[19]。對于復(fù)發(fā)或不能選擇再次切除及再次放療的患者，可采取化療?，F(xiàn)有的化療方案治療效果不佳，兒童患者的10年生存率約60%，成人患者為70%～89%[20]，嬰兒期患者在確診5年后的存活率僅為42%～55%。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點以提高患者的生存率。近年有學(xué)者提出CpG高甲基化和PRC2復(fù)合物的過度活躍使腫瘤抑制基因沉默，導(dǎo)致EPN-PFA的發(fā)生[21]，用去甲基化藥物和PRC2抑制劑治療EPN-PFA能夠使腫瘤抑制基因恢復(fù)表達，抑制腫瘤的進展。此外，這些藥物還對異體移植EPN-PFA具有抑制作用，并能降低其腫瘤啟動能力。目前，該治療方法還需體內(nèi)及體外實驗進一步分析。

綜上所述，運用免疫組化方法對后顱窩EPN標(biāo)本進行H3K27me3蛋白檢測，可以幫助臨床預(yù)測和評估患者的預(yù)后，進而指導(dǎo)臨床對H3K27me3蛋白缺失患者行個體化治療，本實驗為后續(xù)研究EPN的發(fā)病機制和治療提供新的研究方向。