邢靖松，梁 東，克甜甜，張 琳，于如同，高尚鋒

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，呈浸潤性生長，易復(fù)發(fā)，5年生存率不足5%[1]。隨著分子病理學(xué)的發(fā)展，尋找與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵分子，評估其與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系具有重要意義。Spinophilin又名PPP1R9B，最早在神經(jīng)元樹突棘中被發(fā)現(xiàn)[2]，可以與多種跨膜蛋白結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞胞外信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)的生物學(xué)過程[3]?，F(xiàn)有研究表明，Spinophilin在肝癌[4]和乳腺癌[5]中發(fā)揮抑癌作用，然而其在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義尚未見報(bào)道。本文旨在探討Spinophilin在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年2月～2018年2月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的膠質(zhì)瘤標(biāo)本，標(biāo)本均取自瘤中央，無出血、壞死、囊變，且未予電凝。所有膠質(zhì)瘤患者均為原發(fā)，術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。非瘤腦組織標(biāo)本取自同一時(shí)期顱腦外傷患者通過內(nèi)減壓術(shù)切除的新鮮腦組織。共收集冷凍標(biāo)本42例(非瘤腦組織9例，膠質(zhì)瘤組織33例)，所有標(biāo)本提取了總蛋白用于Western blot檢測，6例非瘤腦組織和26例膠質(zhì)瘤組織提取了總RNA用于qRT-PCR檢測；石蠟標(biāo)本29例，其中非瘤腦組織7例，膠質(zhì)瘤組織22例。患者性別、年齡、WHO級別、IDH分型等均從臨床病歷記錄中獲得。本實(shí)驗(yàn)獲患者及家屬知情同意，徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 qRT-PCR檢測TRNzol試劑提取組織總RNA，Nano Drop分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳測定RNA濃度及純度。Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，反應(yīng)條件：55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min后置于4 ℃。以cDNA為模板，加入SYBR-Green染料復(fù)合物、Spinophilin上游引物5′-GCCCAGCTAATTCAG CAGAC-3′和下游引物5′-GGAGCTCCTTGAACTTGT GC-3′，在ABI 7500 PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，對Spinophilin核酸表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.3 免疫組化石蠟切片脫蠟、水化，在檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加Spinophilin一抗(1 ∶200稀釋，AB5669，Millipore公司)，室溫孵育1 h后4 ℃過夜，次日按Vector公司ABC試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，切片脫水、透明、封片，顯微鏡下拍照，Image J軟件分析細(xì)胞核總數(shù)和Spinophilin陽染細(xì)胞數(shù)，計(jì)算Spinophilin陽性細(xì)胞百分比。

1.4 Western blot檢測組織標(biāo)本勻漿后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量組織樣品總蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，按1 ∶10 000加入Spinophilin多克隆抗體(Millipore公司)和β-actin單克隆抗體(sc-47778，1 ∶1 500稀釋，Santa cruz公司)，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(1 ∶4 000稀釋)，室溫孵育2 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，在Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，使用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描，以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算Spinophilin的相對蛋白表達(dá)量。

1.5 生物信息學(xué)分析本組涉及的公共膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集來自于以下網(wǎng)站：CGGA中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(http://www.cgga.org.cn/index.jsp)、TCGA美國腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)(https:// cancergenome.nih.gov)、GSEl6011和GSE4290 mRNA芯片數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc)，利用R2(https://hgserver1.amc.nl)和GEPIA兩個(gè)在線工具分析上述數(shù)據(jù)集，獲得Spinophilin基因表達(dá)差異和Kaplan-Meier生存曲線圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05表述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Spinophilin基因在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)變化在TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中，與非瘤腦組織相比，Spinophilin在低級別膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)量均降低，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A、B)。在GSE16011和GSE4290膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中，與非瘤腦組織相比，Spinophilin在WHO Ⅲ級(P<0.01)和Ⅳ級(P<0.001)膠質(zhì)瘤中低表達(dá)(圖1C、D)。應(yīng)用qRT-PCR檢測本組26例膠質(zhì)瘤樣本也發(fā)現(xiàn)，Spinophilin mRNA在WHO Ⅱ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中表達(dá)量均有所下降，在WHO Ⅳ級中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1E)。

圖1 A.TCGA低級別腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中Spinophilin表達(dá)：非瘤腦組織207例，腫瘤組織518例；B.TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)集中Spinophilin表達(dá)：非瘤腦組織207例，腫瘤組織163例；C.GSE16011膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中Spinophilin表達(dá)：非瘤腦組織8例，膠質(zhì)瘤WHO Ⅱ級24例，Ⅲ級85例，Ⅳ級159例；D.GSE4290膠質(zhì)瘤中Spinophilin表達(dá)：非瘤腦組織27例；膠質(zhì)瘤WHO Ⅱ級45例，Ⅲ級31例，Ⅳ級77例；E.本組膠質(zhì)瘤中Spinophilin表達(dá)：非瘤腦組織6例，膠質(zhì)瘤WHO Ⅱ級10例，Ⅲ級8例，Ⅳ級8例；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.2 不同IDH分型膠質(zhì)瘤中Spinophilin基因的表達(dá)在GSE16011膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中，Spinophilin在IDH1野生型膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)低于IDH1突變型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)；CGGA數(shù)據(jù)集中與該結(jié)果類似(P<0.001，圖2B)。本組33例膠質(zhì)瘤冷凍樣本中具有明確IDH1狀態(tài)的病例17例，qRT-PCR檢測亦證實(shí)，Spinophilin mRNA在IDH1野生型膠質(zhì)瘤中的表達(dá)低于IDH1突變型(P=0.10，圖2C)。

圖2 不同IDH分型膠質(zhì)瘤中Spinophilin的表達(dá)：A.GSE16011膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中Spinophilin表達(dá)，IDH突變型83例，IDH野生型143例；B.CGGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中Spinophilin表達(dá)，IDH突變型356例；IDH野生型286例；C.本組膠質(zhì)瘤中Spinophilin的表達(dá)，IDH1突變型10例，IDH1野生型7例；*P<0.05，***P<0.001

2.3 不同級別膠質(zhì)瘤中Spinophilin蛋白的表達(dá)免疫組化檢測Spinophilin蛋白陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖3A)，與非腫瘤腦組織相比，Spinophilin陽性細(xì)胞百分比在不同級別膠質(zhì)瘤組織中均有所下調(diào)，在WHO Ⅱ級(P<0.01)、Ⅲ級(P<0.01)中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與非瘤腦組織相比，Spinophilin蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)下降，在WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

2.4 Spinophilin表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系在CGGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，Spinophilin高表達(dá)預(yù)示著膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較好，其高表達(dá)與較好的預(yù)后主要存在于WHO Ⅱ級(P=0.041)和Ⅲ級(P=0.033)膠質(zhì)瘤，而不是WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤(P=0.39)。

圖5 CGGA數(shù)據(jù)集分析Spinophilin與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系：A.WHO Ⅱ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中Spinophilin高表達(dá)組的總生存時(shí)間顯著長于低表達(dá)組，n=409；B.WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤中Spinophilin高表達(dá)與較長的總生存時(shí)間顯著相關(guān)，n=133；C.WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤中Spinophilin高表達(dá)與較長的總生存時(shí)間顯著相關(guān)，n=141；D.在WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤中Spinophilin表達(dá)與生存期無關(guān)，n=135

3 討論

蛋白磷酸酶與蛋白激酶共同調(diào)節(jié)底物的磷酸化，在腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤中發(fā)揮重要作用[6]。Spinophilin最早被視作一種與磷酸酶PP1結(jié)合的蛋白質(zhì)[7]，近年研究發(fā)現(xiàn)，其在肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中低表達(dá)[4,8]。本組亦發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中Spinophilin mRNA和蛋白均低表達(dá)，并與患者較短的生存期相關(guān)。此外，在肺癌特別是鱗狀細(xì)胞癌中，Spinophilin下調(diào)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[9]。因此，Spinophilin可能是一個(gè)重要的腫瘤抑制蛋白。

文獻(xiàn)報(bào)道在肝癌細(xì)胞中下調(diào)Spinophilin，可增加Cyclin D2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。在乳腺癌細(xì)胞中，下調(diào)Spinophilin可增加腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性，提高乳腺癌細(xì)胞侵襲能力[10]。低表達(dá)Spinophilin的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示出，Rac1活性降低、侵襲偽足數(shù)量增加和細(xì)胞外基質(zhì)降解增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，過表達(dá)Spinophilin可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。Spinophilin作為肌動蛋白的結(jié)合蛋白，與細(xì)胞運(yùn)動密切相關(guān)[12]，其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲中的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，Spinophilin低表達(dá)或缺失在肺癌和結(jié)直腸癌中常伴隨TP53基因突變，兩者可能在腫瘤發(fā)生上存在一定的協(xié)同作用[13]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，本組通過大樣本數(shù)據(jù)分析和小樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Spinophilin在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，與患者較差的預(yù)后相關(guān)。Spinophilin有望成為膠質(zhì)瘤分子病理診斷的生物標(biāo)志物和抗膠質(zhì)瘤藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。但本課題中納入臨床樣本量有限，導(dǎo)致本組部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)存在一定偏倚。