胡 月，程嵐卿，王 弦,2，王志皓，吳 強,2

化生性乳腺癌(metaplastic breast cancer, MBC)是一組異質(zhì)性腫瘤，其特征是腫瘤性上皮向鱗狀細胞和(或)間葉樣成分分化，包括但不限于梭形細胞、軟骨樣和骨樣細胞[1]。MBC往往伴有浸潤性導管癌非特殊型(invasive ductal carcinoma of no special type, IDC-NST)成分。目前對于MBC的化生亞型與預后的關(guān)系仍存在爭議。MBC整體生存率不佳，容易出現(xiàn)局部復發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移，且目前尚無有效的預后指標[2]。

本課題組前期研究顯示，乳腺癌中腫瘤相關(guān)中性粒細胞(tumor-associated neutrophils, TANs)浸潤與乳腺癌患者無瘤生存期呈負相關(guān)[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中腫瘤衍生的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子通過Janus激酶(JAK)信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號通路，激活胃癌中浸潤的中性粒細胞，并表達高水平細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)，進而抑制正常T細胞免疫反應，并且在體內(nèi)促進胃癌的生長和發(fā)展[4]。MBC中尚無關(guān)于TANs和PD-L1相關(guān)性的研究，因此，本實驗利用免疫組化法檢測MBC中TANs的浸潤情況與PD-L1的表達，分析TANs和PD-L1表達的關(guān)系，探究TANs與PD-L1在MBC中的作用及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011～2020年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院存檔的47例MBC手術(shù)切除標本，所有患者術(shù)前均未行新輔助化療，并經(jīng)復查核實。所有腫瘤診斷標準參照WHO(2019)MBC組織學分型。根據(jù)腫瘤成分類型分類：鱗狀細胞癌22例、梭形細胞癌5例、低級別腺鱗癌1例、伴異源性間葉樣分化型9例、混合型10例(含兩種及兩種以上化生成分)。此外，47例MBC中同時具有化生成分和NST成分有41例。MBC患者中位年齡51.6歲。對患者進行隨訪，每半年隨訪1次，隨訪方式為查詢門診病歷或電話隨訪。當患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移、復發(fā)或死亡等事件時作為隨訪終點，隨訪截至2020年8月。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(G10F5，BD Pharmingen公司)，抗人PD-L1兔單克隆抗體(SP142，Abcam公司)，小鼠/兔聚合法檢測通用性試劑盒(北京中杉金橋公司、美國羅氏公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司、美國羅氏公司)。

1.3 方法所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。蠟塊經(jīng)4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色。應用CD66b標記TANs，采用EnVision兩步法進行免疫組化染色；通過Roche BenchMark XT全自動免疫組化儀半抗原及Optiview增強放大系統(tǒng)對癌組織進行PD-L1染色。

1.4 結(jié)果判讀免疫組化結(jié)果判讀由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法對染色切片進行全面觀察，判讀結(jié)果取平均值。TANs計數(shù)[3]：以中性粒細胞胞膜及胞質(zhì)強染色為陽性，計數(shù)10個高倍鏡視野MBC中化生成分癌實質(zhì)浸潤的CD66b陽性中性粒細胞總數(shù)作為其浸潤密度。以TANs浸潤密度的中位數(shù)作為區(qū)分TANs浸潤高、低密度的指標。PD-L1判讀[5]：以細胞膜及細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色點狀或線狀染色為陽性，采用IC計數(shù)法評估免疫細胞(包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞)染色結(jié)果，即任何強度的PD-L1陽性免疫細胞所占腫瘤面積的比例≥1%為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析采用GraphPad(Prism 5.0)和SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學處理。連續(xù)變量的差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗，樣本率之間的比較采用卡方檢驗或費舍爾精確檢驗，應用Spearman等級相關(guān)檢驗進行相關(guān)性分析。用Kaplan-Meier曲線和對數(shù)秩檢驗進行生存分析。使用SPSS 23.0軟件進行多因素Cox回歸分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MBC中TANs浸潤及PD-L1的表達在MBC化生成分癌實質(zhì)及癌間質(zhì)均觀察到TANs浸潤。癌實質(zhì)TANs浸潤密度為0～283.0，浸潤密度中位數(shù)為4.0。其中低密度TANs組中位數(shù)為1.0，平均數(shù)為1.4±1.0；高密度組中位數(shù)為36.0，平均數(shù)為68.2±76.7(圖1～3)。癌間質(zhì)TANs浸潤密度中位數(shù)為1.0，化生成分癌實質(zhì)TANs浸潤密度高于癌間質(zhì)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。PD-L1在單一化生成分型MBC中的陽性率32.4%(12/37)，在混合化生成分型中的陽性率90.0%(9/10)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。本實驗對TANs浸潤密度和PD-L1表達情況進行了自身對照，41例同時具有化生成分和NST成分病例中，化生成分中的TANs浸潤密度高于NST成分(P<0.05，圖5)，化生成分中的PD-L1陽性率高于NST成分(P<0.05，表2)。

圖1 CD66b和PD-L1在鱗狀細胞癌中的表達：A. HE染色；B. 浸潤的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達，Roche BenchMark XT全自動免疫組化 圖2 CD66b和PD-L1在梭形細胞癌中的表達：A. HE染色；B. 浸潤的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達，Roche BenchMark XT全自動免疫組化 圖3 CD66b和PD-L1在伴軟骨樣成分分化型MBC中的表達：A. HE染色；B. 浸潤的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達，Roche BenchMark XT全自動免疫組化

表1 MBC中TANs密度和PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖4 MBC癌實質(zhì)和癌間質(zhì)的TANs浸潤密度差異

圖5 TANs在MBC化生成分癌實質(zhì)與NST成分癌實質(zhì)中的浸潤情況

表2 MBC化生成分和NST成分的PD-L1表達情況

2.2 TANs浸潤密度、PD-L1表達與MBC臨床病理特征的關(guān)系在MBC癌組織中，TANs高密度浸潤與患者年齡>50歲、TNM高分期、遠處轉(zhuǎn)移、ER陰性、高Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05，表1)；PD-L1陽性與HER-2過表達呈正相關(guān)(P<0.05，表1)。生存分析顯示，TANs浸潤密度與患者3年無進展生存期(progression-free survival, PFS)呈負相關(guān)(P<0.01，圖6A)，PD-L1表達與患者3年P(guān)FS無相關(guān)性(P>0.05，圖6B)。MBC患者3年P(guān)FS的Cox多因素分析顯示，MBC中TANs浸潤密度與3年P(guān)FS密切相關(guān)(P<0.05，表3)，是較差的PFS獨立危險因素。TANs浸潤密度與PD-L1表達呈正相關(guān)(rs=0.309，P<0.05，圖7)。

圖6 A. TANs浸潤密度與患者PFS的關(guān)系；B. PD-L1表達與患者PFS的關(guān)系

圖7 MBC癌組織中TANs浸潤密度與PD-L1表達的相關(guān)性

表3 MBC患者3年P(guān)FS的Cox多因素分析

3 討論

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是決定腫瘤生物學行為的關(guān)鍵因素之一[6]。TME包括多種免疫細胞、非免疫細胞和腫瘤細胞[7]。MBC雖然被視為一種具有相對免疫原性的乳腺癌，但研究表明，MBC的TME存在豐富的免疫細胞如腫瘤浸潤淋巴細胞、中性粒細胞等浸潤，并影響其腫瘤進展與預后[8]。

中性粒細胞是抵抗感染和損傷的第一道防線。過去認為，TME中中性粒細胞可能是防御性免疫反應的指標，然而最新研究顯示TANs可以增強局部腫瘤的生長、促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[9]。TANs分泌的彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)在TME中可以降解胰島素受體底物1，進而加強磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和血小板源性生長因子受體之間的相互作用，促進癌細胞的增殖[10]。中性粒細胞釋放的細胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)也能促進腫瘤細胞的增殖。NETs是由具有金屬蛋白酶的DNA支架和活化的中性粒細胞釋放的蛋白質(zhì)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，NETs可直接影響腫瘤細胞，通過激活NF-κB等信號傳導途徑或通過NETs中的NE等蛋白酶促進其增殖[11]。NETs還能促進腫瘤轉(zhuǎn)移、擴散。在小鼠結(jié)腸癌實驗中發(fā)現(xiàn)，NETs在體外通過激活小鼠結(jié)腸癌細胞中TLR9生長信號通路釋放高遷移率族蛋白B1，從而促進了癌細胞的遷移和侵襲[12]。Park等[13]的研究亦印證了這點，在小鼠三陰型乳腺癌肺轉(zhuǎn)移病灶中NETs的陽性率高于原發(fā)病灶，并且使用脫氧核糖核酸酶Ⅰ抑制NETs的形成可以顯著減少小鼠三陰型乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。本組中，TANs高密度浸潤MBC組相對于TANs低密度浸潤MBC組具有更高的Ki-67增殖指數(shù)。這表明，MBC中TANs浸潤密度和癌細胞增殖密切相關(guān)，進一步證實了TANs可能會促進癌細胞增殖。此外，本組病例中出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的6例患者均伴隨TANs高密度浸潤(6/6)，明顯高于未轉(zhuǎn)移患者。這表明TANs高密度浸潤與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，TANs在MBC遠處轉(zhuǎn)移過程可能發(fā)揮重要作用。

TANs除了促進MBC癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移，還與MBC的PFS密切相關(guān)。在本組中，TANs高密度浸潤與ER陰性、高TNM分期呈正相關(guān)，與PFS呈負相關(guān)，這一結(jié)果與既往研究一致[14]。多因素分析顯示，TANs浸潤密度與3年P(guān)FS密切相關(guān)，浸潤密度越高，患者出現(xiàn)腫瘤進展的風險越大。這表明，TANs高密度浸潤與MBC進展密切相關(guān)，有望成為一個潛在的MBC生物學標志物。這也為MBC中針對中性粒細胞的靶向治療提供新思路。

TANs還可以通過上調(diào)PD-L1表達，抑制T細胞增殖從而抑制腫瘤免疫反應。Shang等[15]研究證實卵巢癌中HOXA轉(zhuǎn)錄本可以促進中性粒細胞分泌白介素-6，上調(diào)PD-L1表達，從而抑制T細胞免疫反應，最終加速卵巢癌細胞的免疫逃逸。

乳腺癌中PD-L1表達通常與預后不良的臨床病理特征呈正相關(guān)。如在一項關(guān)于PD-L1與乳腺癌臨床病理特征的Meta分析中發(fā)現(xiàn)，PD-L1陽性與HER-2過表達密切相關(guān)[16]。本組中PD-L1陽性與HER-2過表達亦呈正相關(guān)。有研究表明HER-2過表達與MBC的惡性特征直接相關(guān)[17]。此外，PD-L1在存在一種以上化生成分MBC中的陽性率高于單一化生成分型MBC，而存在一種以上化生成分是MBC中無復發(fā)和特異性生存率的不良因素之一[18]。盡管本組中PD-L1表達與患者預后無明顯相關(guān)性(或與樣本量過少有關(guān))，但PD-L1表達與MBC的惡性特征呈正相關(guān)，這提示PD-L1可能影響MBC的進展，也為開展免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICIs)如PD-1/PD-L1抑制劑的免疫治療提供證據(jù)。Al Sayed等[19]在1例轉(zhuǎn)移性MBC中聯(lián)合使用抗PD-L1抗體(durvalumab)與化療藥物紫杉醇，治療效果良好且副作用小。此外ICIs在MBC中的治療效果已進入臨床研究(NCT02834013)。本組中PD-L1的陽性率為44.7%(21/47)，與既往MBC研究中PD-L1的陽性率47.6%大致相符[8]。這提示接近一半對放化療反應不佳的MBC患者可能從ICIs治療中獲益。

研究證實腫瘤組織中中性粒細胞的浸潤密度與PD-L1表達呈正相關(guān)，如膽管細胞癌中TANs密度與PD-L1表達呈正相關(guān)[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，MBC中TANs浸潤密度與PD-L1表達呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。這提示TANs與PD-L1可能共同參與MBC的進展，影響MBC患者的預后。此外，針對中性粒細胞的靶向治療還可以協(xié)助PD-1/PD-L1抑制劑發(fā)揮治療作用。Kargl等[21]研究小鼠肺非小細胞肺癌時發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞抑制劑可協(xié)助PD-1抑制劑攻擊肺癌細胞，使癌灶體積縮小，延緩腫瘤產(chǎn)生耐藥性的時間，這提示中性粒細胞抑制劑也許是ICIs有效的輔助治療手段。

綜上所述，化生成分癌實質(zhì)中浸潤的TANs與MBC進展及PD-L1表達呈正相關(guān)，有望成為MBC無進展生存率的潛在生物學標志物。