候自瓊,朱璽燊,陳 燕,巫 艷,王 一,李成云
(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,云南生物資源保護與利用國家重點實驗室,云南昆明650201;2.瀾滄縣職業(yè)高級中學,云南瀾滄665699)
植物病害中,約有70%~80%是由真菌引發(fā)[1],并且每年造成嚴重的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失。在進行植物病害的診斷過程中,準確鑒定植物病原菌是至關重要的一個環(huán)節(jié)。由于植物病原真菌涉及的種類多,其分類鑒定是一項富有挑戰(zhàn)性的工作。而傳統(tǒng)的鑒定方法主要根據(jù)病原菌的形態(tài)特征、寄主范圍、生長特性及生理生化指標進行鑒定;但真菌個體小,可供使用的形態(tài)特征有限,且一些真菌形態(tài)、生理、生化特征不太穩(wěn)定,易隨環(huán)境條件而發(fā)生變化,僅憑傳統(tǒng)的真菌分類法很難對植物病原真菌進行準確鑒定[2-4]。
對各種棲息環(huán)境中病原菌的種類鑒定、生活習性研究及豐度評估是病害預警的重要環(huán)節(jié)[5-6]。DNA測序等分子生物學技術的迅速發(fā)展,極大地推動了病原菌的棲息環(huán)境和生活史研究[7-9],尤其是DNA條形碼和DNA宏條形碼(Metabarcoding)技術的運用,為物種的鑒定和病原菌種群動態(tài)研究帶來了革命性的變化,極大地提高了鑒定的準確性和應用維度[10]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品流通過程中,對土壤、灌溉水、空氣、雨水中的病原菌檢測以及對攜帶病原菌的種子、種苗、轉主寄主、非寄主植物、包裝材料的檢測方面,更需要在無典型形態(tài)特征(如不產(chǎn)孢的生育時期和狀態(tài))及生物量較少的情況下進行快速靈敏的檢測,DNA條形碼技術在這些檢測中正在被廣泛應用[11-13]。此外,分子檢測技術的開發(fā)還能為重要病原菌的生活史、生物學、代謝以及系統(tǒng)進化等研究提供強有力的工具[14-15]。
國內(nèi)外研究者圍繞真菌DNA條形碼開展了大量的探索,并已被廣泛應用于植物病原真菌系統(tǒng)學研究。其中,使用最多的是核糖體基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS)序列。MARIN等[16-18]對世界范圍內(nèi)不同地區(qū)大多數(shù)植物病原真菌的種類及其DNA條形碼進行了系統(tǒng)整理,并建立了GOPHY(Genera of Phytopathogenic Fungi)網(wǎng)站。通過分子數(shù)據(jù)的整合和分析,為植物病原真菌鑒定提供了重要參考信息。
本研究對DNA條形碼在植物病原真菌鑒定方面的運用現(xiàn)狀和潛力進行了綜述,指出了當前DNA條形碼運用的優(yōu)點及局限性,同時對目前國際上植物病原真菌DNA條形碼的記錄和中國農(nóng)作物病原真菌DNA條形碼的記錄進行了分析,并對其在植物病原真菌中分類鑒定的重要作用進行了展望,旨在為植物病原真菌的診斷、真菌病害的預警和監(jiān)測提供依據(jù)。1 DNA條形碼在植物病原真菌鑒定中的運用
DNA條形碼是一些標準化的、有足夠變異、易擴增且相對較短的小片段序列[19]。目前,常用于植物病原真菌分子鑒定的DNA條形碼片段主要包括核糖體編碼基因,如核糖體RNA(rRNA)、內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS)、核糖體大亞基基因(LSU)、核糖體小亞基18S基因(18S)、基因間間隔區(qū)(IGS)等,以及蛋白編碼基因,如甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、鈣調蛋白基因(CAL)、肌動蛋白基因(ACT)、翻譯延伸因子(TEF)、RNA聚合酶II第二大亞基(RPB2)、超氧化物歧化酶基因(SOD2)等[20-21]。這些基因片段都被不同程度地應用到植物病原真菌的分類研究中。
由于自身序列小、種間變異率小、使用范圍廣等多種優(yōu)勢,ITS被推選為真菌的標準條形碼[22]。ITS序列在植物病原真菌分類鑒定中的使用非常普遍,對大多數(shù)植物病原真菌屬都能夠進行準確鑒定。然而,該標記仍然存在一定的局限性,使用ITS建立的系統(tǒng)發(fā)育樹對于一些近緣物種或是在一些關鍵的進化節(jié)點上支持率很低,無法有效地進行分類[23]。還有研究報道,使用ITS分子標記無法準確鑒定一些植物病原真菌屬中的種,如鐮刀菌屬和鏈格孢屬等[24]。為了準確對植物病原真菌進行鑒定,研究者們將其他具有辨識度的基因片段運用到分子系統(tǒng)學的研究中。β-微管蛋白基因(β-tubulin)和翻譯延伸因子(TEF)也是重要的植物病原真菌條形碼,在所有真核生物中都發(fā)現(xiàn)了β-微管蛋白基因,并已被應用于真菌在種水平的系統(tǒng)發(fā)育分析[25]。β-微管蛋白基因包含了很多系統(tǒng)學研究信息,更適合屬、種的系統(tǒng)進化研究,因此被認為是分析系統(tǒng)發(fā)育和復雜物種的DNA條形碼[26]。真核生物延伸因子-1α基因(EF-1α)在種屬水平上也是一種理想的分子標記,該基因片段在鐮刀菌屬具有較高的物種識別率,已被廣泛運用到鐮刀菌屬物種的鑒定中[27]。越來越多的DNA條形碼被運用到植物病原真菌的分類鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育研究中,但其他候選條形碼通常只在一些特定的種屬鑒定、近緣物種或復合群的鑒定中發(fā)揮重要作用。
采用單個DNA條形碼能夠對一部分植物病原真菌進行準確分類鑒定,但由于真菌的遺傳差異較大,單一的條形碼往往不能區(qū)分一些類群中的所有物種。面對單個條形碼在植物病原真菌分類鑒定中的局限性,TALHINHAS等[28]首次建立了多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹,用ITS、β-微管蛋白基因(TUB2)、組蛋白H4基因(HIS4)3個基因序列聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹,綜合地分析了尖孢刺盤孢(Collewtrichum acutatum)復合群。此后,多基因聯(lián)合鑒定廣泛運用于植物病原真菌的系統(tǒng)學研究中。林春花等[29]對海南橡膠樹上的暹羅刺盤孢菌(Colletotrichum siamense)和果生刺盤孢菌(Colletotrichum fructicola)進行鑒定,指出單個DNA條形碼序列(ITS、ACT、幾丁質合成酶-1基因(CHS-1)、GAPDH或Apn2-Mat1-2基因間隔區(qū)基因(ApMat))只能將其鑒定到復合群,需要采用多基因聯(lián)合的方式對復合群的種間進行分類。李朋華[30]基于ITS、EF-1α、HIS、RPB2、ACT這5個DNA條形碼對部分鏈格孢屬真菌進行鑒定,結果同樣表明,多基因聯(lián)合鑒定比單個DNA條形碼鑒定更加有效,能夠將多數(shù)物種區(qū)分開來。BAKHSHI等[31]比較了ITS等8個分子標記對尾孢菌屬(Cercospora)分類鑒定的價值,指出了以GAPDH為主,輔以鈣調蛋白基因CMDA、翻譯延長因子1α(TEF1)和TUB2這3個DNA條形碼,可以有效地將尾孢菌屬中的不同種區(qū)別開。多基因聯(lián)合分析在植物病原真菌的分類鑒定中運用越來越廣泛,通常采用核糖體編碼基因ITS聯(lián)合編碼蛋白基因進行鑒定,使用多個基因聯(lián)合鑒定可靠性要高于單個條形碼,因此,這也成為目前分子系統(tǒng)學發(fā)展的趨勢。
擁有足夠的分子數(shù)據(jù)對準確鑒定植物病原真菌十分重要。目前,GenBank、QBOL、EMBL、DDBJ、AFTOL、UNITE以及Mycobank等數(shù)據(jù)庫中都收錄了DNA條形碼數(shù)據(jù)。檢索DNA條形碼在GeneBank數(shù)據(jù)庫中的記錄情況能夠有效了解當前不同DNA條形碼在植物病原真菌分類鑒定過程中的運用情況,對分析大范圍的植物病原真菌分子數(shù)據(jù)現(xiàn)狀具有重要意義。
GOPHY網(wǎng)站的建立與“The Genera of Fungi Project”這一項目有關,是國際真菌分類學委員會項目中的一部分內(nèi)容,旨在為植物病原真菌的分類提供一個便捷的平臺(http://www.plantpathogen.org/)。目前,有關GOPHY的系列文章里記錄了植物病原真菌屬的最新概況,以及目前國際上普遍報道的種及其DNA條形碼的概況[16-18],系統(tǒng)介紹了64個屬的植物病原真菌及其DNA條形碼,代表了國際上植物病原真菌DNA條形碼的研究進展,這64個屬中共包含了1 983種植物病原真菌。對GOPHY中的植物病原真菌所描述的DNA條形碼進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn),共有1 982種在GeneBank中有序列記錄,占比為99.95%,多以ITS為主,TEF1基因序列次之。目前,有92%以上的植物病原真菌有ITS序列記錄,有59%的植物病原真菌有TEF1基因序列記錄,其余植物病原真菌DNA條形碼的運用小于50%(圖1)。
為了解引發(fā)中國農(nóng)作物病害的植物病原真菌DNA條形碼的記錄情況,本文整理了《中國農(nóng)作物病蟲害(3版)》上冊、中冊、下冊3本圖書中所有的植物病原真菌,并在GeneBank中檢索了這些植物病原真菌的分子數(shù)據(jù)信息,結果表明,共有205個屬的691種引發(fā)中國農(nóng)作物病害的植物病原真菌,其中有435種在GeneBank中能檢索到DNA條形碼信息,占比為62.95%。如圖1所示,62%以上的中國農(nóng)作物病原真菌有ITS序列信息,7.7%有GAPDH基因序列信息,其余的TEF1、CHS-1、組蛋白H3基因(HIS3)等19個重要分子標記在中國農(nóng)作物病原真菌中的運用還非常少。此外,還有256種中國農(nóng)作物病原真菌在GeneBank中未找到任何分子數(shù)據(jù)的信息??梢?,我國記錄的農(nóng)作物病害中目前仍有一部分植物病原真菌分子信息有待完善。建立和完善我國植物病原真菌的DNA條形碼數(shù)據(jù)信息,可為中國作物病害的快速準確鑒定、地域分布、動態(tài)變化和有效管理提供基礎信息。
將《中國農(nóng)作物病蟲害(3版)》中的植物病原真菌種類與GOPHY中植物病原真菌進行比對,結果表明,目前只有61種中國農(nóng)作物病害真菌能夠在GOPHY中檢索到,90%以上(630種)的中國農(nóng)作物病害真菌還未被GOPHY收錄。這部分未被收錄的中國農(nóng)作物病原真菌中共有374種有DNA條形碼記錄,其中,98%的植物病原真菌(368種)在GeneBank中都有ITS序列記錄;此外,有90種植物病原真菌還有其他DNA條形碼記錄(圖2)。可以看出,這部分植物病原真菌的TUB2、RPB2和GAPDH基因序列記錄相對較高。
目前,采用DNA條形碼技術能夠將大多數(shù)植物病原真菌鑒定到種屬水平[32]。通過分析植物病原真菌鑒定過程中DNA條形碼整體的運用狀況,可以看出,絕大部分植物病原真菌都有ITS序列記錄,部分植物病原真菌還查詢到其他DNA條形碼的記錄。但對《中國農(nóng)作物病蟲害(3版)》中植物病原真菌的DNA條形碼進行分析后發(fā)現(xiàn),目前仍然存在一部分植物病原真菌缺乏相關的分子數(shù)據(jù),甚至還未有ITS序列記錄。若只根據(jù)形態(tài)學進行分類,則很難在屬以下水平精確鑒定。因此,還需加強對DNA條形碼信息的進一步完善,以便能夠提高鑒定準確性。
由于病原真菌的種屬差異大、數(shù)量多、基因序列變異度也高,很難篩選出適合所有物種的單個標準條形碼[33-34]。在這種背景下,選擇物種識別率高的分子標記對植物病原真菌的種屬進行鑒定尤為重要,應根據(jù)不同種屬的特性建立適合的DNA條形碼片段。目前,有大量研究致力于篩選植物病原真菌特定種屬的最適DNA條形碼。LAWRENCE等[35-36]對鏈格孢屬病原真菌進行了大量分析,結果表明,在物種水平上,最適合鏈格孢屬分子鑒定的遺傳標記是質膜ATP酶基因(ATPase)和CMDA基因。朱兆香等[37]以木霉屬的多個物種為材料,選擇ITS、RPB2和TEF1作為候選條形碼,最終建議RPB2基因作為木霉屬首選DNA條形碼。FILIPA等[38]對西非地區(qū)腰果病害的研究中也證實,GAPDH、GS和ApMat可作為炭疽菌屬病原真菌鑒定的最適條形碼。篩選植物病原真菌屬識別率較高的DNA條形碼,對快速準確鑒定具有重要意義;另外,也應該考慮在現(xiàn)有植物病原真菌條形碼的基礎上,開發(fā)分辨率更加精細的DNA條形碼,尤其對于檢疫性病害,如近年在巴西初發(fā),并已經(jīng)擴展到孟加拉的麥瘟病[39],更需要建立種水平以下的精準分子標記,才能對其可能產(chǎn)生的風險作出準確評估,將其危害控制到最低程度。
處于自然環(huán)境下的植株通常會感染多種病原菌,在這種情形下,DNA條形碼技術不能快速準確地進行鑒定。因此,還需要結合其他分子診斷技術,如多重PCR技術、qPCR技術、Macroarray技術、DNA Metabarcoding技術等[40-41],以提高植物病原真菌鑒定的準確性和時效性。多重PCR技術在同時感染多種病原菌的植物上運用非常廣泛,CHO等[42]通過DNA條形碼并結合多重PCR技術對進出口的仙人掌進行檢測,結果同時檢測到了尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、仙人掌平臍蠕孢(Bipolaris cactivora)、煙草疫霉病菌(Phytophthora nicotinae)和三七疫霉病菌(Phytophthora cactorum)4種病原菌,極大地提高了病原微生物的檢測效率。Macroarray技術由于具有較高的靈敏度,目前也成為植物病原真菌診斷的分子工具,該技術在茄科作物病原真菌的鑒定上已被廣泛運用[43]。DNA Metabarcoding技術也顯示出了在植物病原真菌鑒定中的巨大潛力,該技術能夠快速準確地鑒定混合樣品,此外,還實現(xiàn)了從物種識別到生物多樣性評估的重要轉變[44-45]。檢測病原菌在寄主植物、非寄主植物及其在非農(nóng)業(yè)生境中的生物量可為植物病害的預警提供基礎信息,也能為這些微生物生態(tài)功能的探索提供重要線索[46]。DNA條形碼與其他診斷技術的結合無疑為這些研究提供了重要保障。
農(nóng)作物和農(nóng)產(chǎn)品中攜帶的有害生物是影響作物生長、糧食安全和食品安全的重要因子,對病原菌等有害生物的快速準確鑒定是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展必不可少的技術,也是應對農(nóng)產(chǎn)品國際流通和全球氣候變化給植物病害的傳播、流行帶來新挑戰(zhàn)所必不可少的技術。據(jù)估計,地球上存在著150萬種真菌,但目前被報道的還不足5%[40,47],因此,DNA條形碼技術在未來的物種鑒定、植物病害診斷中仍然會占據(jù)著重要地位。
在本文描述的分子標記中,ITS、RNA聚合酶Ⅱ第一大亞基基因(RPB1)、RPB2和LSU已經(jīng)發(fā)展為Metabarcoding標記,尤其是ITS已被廣泛地應用于環(huán)境樣品中真菌物種多樣性評估和影響機制的研究領域[33,48]。盡管基因組測序的研究進展十分迅速,但利用分子標記進行快速鑒定仍有其突出優(yōu)點,如快捷、高效、低成本等。今后無論是國外重要病原菌還是國內(nèi)危害嚴重的植物病原菌,都應建立多位點、高通量、快速準確和高效鑒定農(nóng)產(chǎn)品中有害微生物的技術,才能確保病害的準確診斷、風險預警及有效管理,也才能為農(nóng)產(chǎn)品的安全性管理提供技術支撐。
本文對中國農(nóng)作物病原真菌及其DNA條形碼的數(shù)據(jù)進行了整理,結果發(fā)現(xiàn),這部分植物病原真菌的分子數(shù)據(jù)還存在不足。對于已經(jīng)建立了單個分子標記的種類,也還需要根據(jù)病原菌的種類進行完善,因為癥狀相似的植物病害在不同地區(qū)病原物也可能有所不同[4],應至少采用2~3個DNA條形碼對物種進行鑒定。今后,還需要建立系統(tǒng)的有害生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,并開發(fā)智能化、高效靈敏的檢測技術體系,構建不同層次、適合不同用戶使用的高效管理和檢索體系。這不但是我國未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要,也是構建“一帶一路”體系中農(nóng)產(chǎn)品安全高效流通管理體系的需要。