陳 穎，康剛勁，王妍茜，徐曼華，楊 濤

?KEYWORDS:cataract; human lens epithelial cells; pyroptosis; estrogen

0引言

白內(nèi)障是目前全世界致盲的最常見疾病[1]，其中年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)病率最高。既往多數(shù)學者認為白內(nèi)障的產(chǎn)生是由于晶狀體上皮細胞在各種致病因素刺激下, 發(fā)生過度凋亡, 導致晶狀體發(fā)生一系列病理改變，并表明晶狀體上皮細胞的凋亡是除了先天性白內(nèi)障以外其他類型白內(nèi)障的病理學基礎[2]。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)在年齡相關性白內(nèi)障中還存在著一種不同于細胞凋亡的細胞程序性死亡——細胞焦亡[3]。當晶狀體上皮細胞在氧化應激下，可產(chǎn)生大量活性氧，促使細胞焦亡，誘發(fā)白內(nèi)障。

細胞焦亡是一種伴隨炎癥反應的細胞程序性死亡[4]。其途徑分為兩型，即經(jīng)典型與非經(jīng)典型。經(jīng)典型焦亡途徑是通過細胞內(nèi)模式識別受體接收刺激信號后，借助凋亡相關微粒蛋白(CARD-domain containing adaptor protein,ASC)與半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，pro-caspase-1)結合，形成炎性復合體，促發(fā)細胞焦亡的發(fā)生。模式識別受體包括NLRs受體(NOD-like receptors)、Toll樣受體(Toll-like receptors)和PYHIN蛋白。而目前研究較多也較成熟的通路為核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)參與及依賴半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)介導的經(jīng)典型焦亡途徑。當NLRP3接收外界刺激信號后，借ASC與pro-caspase-1結合，形成NLRP3炎癥小體[5]。激活自身蛋白酶后，生成有催化活性的Caspase-1。Caspase-1切割GSDMD(gasderminD)，釋放N-端結構域(GSDMD-N)。GSDMD-N遷移在質膜上形成非特異性孔洞，從而促進細胞滲透裂解。Caspase-1活化后可以刺激白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的釋放，從而擴大炎癥反應[6]。

雌激素被認為具有保護人晶狀體上皮細胞的作用[7-8]，其機制與抗凋亡、抗氧化等相關。而此保護機制是否與抗焦亡相關，目前仍無有關的研究。故本文旨在探究雌激素對人晶狀體上皮細胞的保護機制與細胞焦亡的相關性，為局部及全身用藥預防年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展提供新的研究思路。

1材料和方法

1.1材料人晶狀體上皮細胞HLE-B3細胞系(ATCC，美國)，17-β雌二醇(17β-estradiol，E2)粉末，H2O2試劑(Sigma，美國)，噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)粉，BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)，TUNEL試劑盒(Roche，英國)，CCK-8檢測試劑盒(上海碧云天公司)，Caspase-1抗體(Novus，美國)，GSDMD抗體(Thermo，美國)，NLRP3抗體(武漢三鷹，中國)、GAPDH抗體(Abcam，英國)，IL-1β檢測試劑盒(云克隆，中國)，超凈工作臺(Thermo，美國)，恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，共聚焦顯微鏡(Leica，德國)，電泳儀(BIORAD，美國)，紫外分光光度計(HACH，美國)，膠片分析儀(天能公司，中國)，掃描電子顯微鏡(Tescan，中國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及傳代將HLE-B3細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于37℃、含體積分數(shù)為5%CO2的恒溫孵箱培養(yǎng)，隔天換液。待細胞生長至對數(shù)期，按1∶3比例傳代，每3d傳代一次。待細胞經(jīng)4次傳代生長穩(wěn)定后進行后續(xù)實驗。

1.2.2MTT法確定H2O2處理濃度及時間將處于生長對數(shù)期的細胞消化混勻后，計數(shù)板計數(shù)，細胞濃度為每毫升10×104個，按每孔100μL細胞懸液接種于96孔板中。次日棄去96孔板中培養(yǎng)基，加入含0、50、100、200μmol/L H2O2培養(yǎng)基，分別處理6、12、24h。棄去孔板中的培養(yǎng)基后，加入200μL培養(yǎng)基、20μL濃度為5mg/L MTT溶液。恒溫箱中作用4h后棄去培養(yǎng)基及MTT溶液，加入150mL DMSO洗去多余結晶，酶標儀檢測光吸收值。

1.2.3實驗分組根據(jù)MTT法確定H2O2處理濃度為100μmol/L，時間為12h。隨機將細胞依據(jù)參考文獻[22,25]分為五組。空白對照組:含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)HLE-B3細胞；H2O2處理組：培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，加入含100μmol/L H2O2的培養(yǎng)基處理12h；雌二醇1組(1×10-3μmol/L雌二醇+H2O2處理組)；雌二醇2組(1×10-2μmol/L雌二醇+H2O2處理組)；雌二醇3組(1×10-1μmol/L雌二醇+H2O2處理組)。

1.2.4免疫熒光染色檢測GSDMD蛋白的分布及熒光強度將處理后的細胞進行消化、離心，細胞懸液滴加至蓋玻片上培養(yǎng)約6h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30min，加入GSDMD一抗于4℃孵育過夜。洗滌后予以二抗室溫孵育50min。滴加DAPI染液，室溫孵育5min后洗滌3次。滴加適量的抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5CCK-8檢測各組細胞活力取出細胞，胰蛋白酶消化，配制成濃度為每毫升1×105個的細胞懸液，按10 000個細胞/孔接種于96孔板，每孔加100μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)實驗分組處理。每個濃度的樣本設五個復孔。所有孔中加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2h。酶標儀測定450nm光密度值(optical density，OD)。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.6TUNEL法檢測細胞焦亡待細胞爬片后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30min，按TUNEL試劑盒說明書操作，DAPI染液染色，室溫避光孵育5min，洗滌3次。滴有抗熒光淬滅劑的蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7Western-blot法檢測GSDMD和NLRP3及Caspase-1蛋白濃度用PBS緩沖液潤洗貼壁細胞3次，加入細胞總蛋白提取試劑使細胞完全裂解。收集上清液，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。確定每個樣品總蛋白上樣量均為40μg。電泳、轉膜。將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1h，一抗稀釋液4℃孵育過夜。洗滌干凈后，二抗稀釋液室溫孵育30min。PBS洗滌后曝光、顯影。由Alpha Ease FC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.2.8ELISA法檢測IL-1β含量將細胞懸液，按1 000個細胞/孔接種于96孔板，每孔加100μL。待貼壁后根據(jù)分組加入含不同濃度雌二醇培養(yǎng)基，空白對照組更換為含胎牛血清的培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24h后。H2O2處理組及各雌二醇組加入含100μmol/L H2O2培養(yǎng)基處理12h。每組設置 3 個復孔。經(jīng)冰凍溶解、低溫離心后收集上清液。包被、封閉、顯色后，加入終止液，最后分光光度計各孔OD值，設置波長為450nm。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結果用均數(shù)±標準差表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2結果

2.1掃描電子顯微鏡下觀察各組HLE-B3細胞形態(tài)變化情況在掃描電子顯微鏡下觀察到空白對照組與雌二醇3組中細胞形態(tài)呈圓形，邊界清楚(圖1)。而在H2O2處理組、雌二醇1組、雌二醇2組中可見明顯細胞形態(tài)不規(guī)則。在H2O2處理組、雌二醇1組中出現(xiàn)細胞形態(tài)稍腫脹、“囊泡”及“孔隙”形成。而在雌二醇2組中細胞腫脹不明顯，但仍有“囊泡”及“孔隙”形成。

2.2免疫熒光染色檢測雌二醇對GSDMD免疫熒光的影響共聚焦顯微鏡下觀察雌二醇對HLE-B3細胞中GSDMD免疫熒光的影響。當特異性抗體與細胞膜上的GSDMD相結合后，在共聚焦顯微鏡下可觀察到紅色熒光(圖2)。各組熒光強度情況比較差異有統(tǒng)計學意義(F=38.656，P<0.001，表1)。H2O2處理組中熒光強度高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與H2O2處理組相比較，各雌二醇組中免疫熒光強度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在一定濃度范圍內(nèi)，熒光強度隨雌二醇濃度遞增而呈減弱趨勢。

圖2 免疫熒光染色檢測各組HLE-B3細胞熒光強度 A:空白對照組;B:H2O2處理組;C:雌二醇1組;D:雌二醇2組;E:雌二醇3組。

2.3CCK-8法檢測雌二醇對HLE-B3細胞活力的影響各組細胞存活率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=81.275，P<0.001，表1)。H2O2處理組細胞活力較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2處理組相比，各雌二醇組細胞活力升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，細胞存活率隨雌二醇濃度遞增而呈遞增趨勢。

2.4雌二醇對細胞焦亡率的影響TUNEL法經(jīng)檢測細胞發(fā)生DNA的斷裂情況從而檢測各組HLE-B3細胞的焦亡情況(圖3)。各組細胞焦亡情況比較差異有統(tǒng)計學意義(F=455.585，P<0.001，表1)。H2O2處理組細胞焦亡率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與H2O2處理組相比較，各雌二醇組中細胞焦亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，細胞焦亡率隨雌二醇濃度遞增而呈遞減趨勢。

圖3 TUNEL法檢測各組HLE-B3細胞焦亡情況 A:空白對照組;B:H2O2處理組;C:雌二醇1組;D:雌二醇2組;E:雌二醇3組。

2.5Western-blot法檢測NLRP3和GSDMD和Caspase-1蛋白表達情況

2.5.1Western-blot法檢測雌二醇對NLRP3蛋白表達的影響各組NLRP3蛋白表達(灰度比)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=60.866，P<0.001，表1)。H2O2處理組NLRP3蛋白表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2處理相比，各雌二醇組中NLRP3蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在雌二醇組中NLRP3蛋白表達兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，NLRP3蛋白隨雌二醇濃度遞增而呈遞減趨勢，見圖4。

2.5.2Western-blot法檢測雌二醇對GSDMD蛋白表達的影響各組GSDMD蛋白表達(灰度比)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=63.886，P<0.001，表1)。H2O2處理組GSDMD蛋白表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2處理相比，各雌二醇組中GSDMD蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在雌二醇組中GSDMD蛋白兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，GSDMD蛋白隨雌二醇濃度遞增而呈遞減趨勢，見圖5。

2.5.3Western-blot法檢測雌二醇對Caspase-1蛋白表達的影響各組Caspase-1蛋白表達(灰度比)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=10.918，P=0.001，表1)。H2O2處理組Caspase-1蛋白表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2處理相比，各雌二醇組中Caspase-1蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雌二醇各組中Caspase-1蛋白兩兩比較，雌二醇2組與雌二醇3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.35)，雌二醇1組與雌二醇2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.27)，而雌二醇1組與雌二醇3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)，見圖6。

圖6 Western-blot法檢測雌二醇對Caspase-1蛋白表達的影響 A:空白對照組;B:H2O2處理組;C:雌二醇1組;D:雌二醇2組;E:雌二醇3組。

2.6ELISA法檢測雌二醇對IL-1β分泌量的影響各組IL-1β分泌量比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=100.632，P<0.001，表1)。H2O2處理組IL-1β分泌量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與H2O2處理組相比較，各雌二醇組中IL-1β分泌量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雌二醇組中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在一定雌二醇濃度范圍內(nèi)，隨著雌二醇濃度遞增，而IL-1β濃度呈遞減趨勢。

表1 各組相關指標檢測結果

3討論

隨著我國人口的老齡化，年齡相關性白內(nèi)障已成為嚴重影響人民生活水平的疾病之一。然而，目前白內(nèi)障尚無有效的預防措施，其主要且有效的治療方式仍然是手術。手術治療所需的費用、耗材，以及患者需承擔的痛苦及手術風險等都成為需要被重視和解決的問題。因此，明確年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)病機制，進一步探求防治方法已成為一項刻不容緩的工作。

在1992年，Zychlinsky等[9]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞經(jīng)福氏志賀氏桿菌誘導可發(fā)生一種異于凋亡和壞死的細胞程序性死亡。直到2001年正式將這種由Caspase-1介導的細胞死亡方式命名為“Pyroptosis”，即：細胞焦亡[10]。目前已在多種疾病中被發(fā)現(xiàn)存在細胞焦亡，比如細菌病毒感染、非酒精性脂肪性肝炎、腫瘤、慢性阻塞性肺疾病等。Jin等[3]研究發(fā)現(xiàn)在年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)生中也存在細胞焦亡。

細胞焦亡及凋亡均屬于細胞程序性死亡。曾經(jīng)有研究以玻璃體腔內(nèi)注射淀粉樣β蛋白(Aβ)后的大鼠為模型，發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜色素上皮細胞可同時發(fā)生凋亡和焦亡[11]。兩者的相同之處在于：均可發(fā)生DNA斷裂、細胞核皺縮、形成“囊泡”[12]。不同之處在于，凋亡不發(fā)生質膜的破裂，而在焦亡過程中，由于GSDMD-N形成的非特異性孔洞，可導致細胞滲透裂解[13]。本實驗中，經(jīng)H2O2處理的人晶狀體上皮細胞，在掃描電子顯微鏡觀察可見細胞形態(tài)稍腫脹以及“囊泡”“空隙”形成，并且細胞活力下降、焦亡率升高。而經(jīng)一定濃度雌二醇誘導后，細胞腫脹程度及“囊泡”“空隙”形成較改善，細胞活力升高、焦亡率下降，并隨雌二醇濃度改變而改變。說明一定濃度的雌二醇對維持晶狀體上皮細胞的正常形態(tài)及活力有一定作用并且具有濃度依賴性。

細胞焦亡的途徑分為由Caspase-1介導的經(jīng)典途徑以及由Caspase-4、5、11介導的非經(jīng)典途徑[14]。細胞焦亡經(jīng)典途徑通過形成炎性小體，生成有催化活性的Caspase-1，Caspase-1可切割GSDMD，促發(fā)焦亡的發(fā)生，同時可促發(fā)炎癥因子的釋放從而擴大炎癥反應。Caspase-1是一種炎性Caspase，且Duprez等[15]認為Caspase-1不參與細胞凋亡。Sun等[16]研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細胞中Caspase-1前體及Caspase-1蛋白表達高于正常對照組。本研究亦發(fā)現(xiàn)H2O2可促使HLE-B3細胞中Caspase-1蛋白及IL-1β表達上調，并且一定濃度雌二醇可下調Caspase-1蛋白的表達及IL-1β的分泌，并且在此濃度范圍內(nèi)，Caspase-1蛋白表達及IL-1β分泌可隨雌二醇濃度的遞增而遞減。

NLRP3是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLR)家族的一員，與ASC及Caspase-1前體組裝后所得的復合體被稱為NLRP3炎性小體，可促發(fā)Caspase-1的激活。Zou等[17]認為抑制NLRP3可明顯減輕H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)HLE-B3經(jīng)H2O2誘導后，可促進NLRP3蛋白表達上調；而雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)可下調NLRP3蛋白的表達，且在該范圍內(nèi)，其表達可隨雌二醇濃度的升高而降低。

Gasdermin蛋白家族由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME(DFNA5)和DFNB59組成[18]，而GSDMD在NLRP3炎癥小體引發(fā)的細胞焦亡途徑起著重要的作用[19]。Wang等[20]以短波長藍光照射大鼠，經(jīng)12wk后，所有實驗組大鼠均出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁，并且發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠晶狀體上皮細胞中GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA的表達均較對照組上調，認為細胞焦亡在白內(nèi)障的發(fā)生中起關鍵作用。本研究經(jīng)熒光免疫染色實驗發(fā)現(xiàn)GSDMD位于人晶狀體上皮細胞膜上，H2O2可上調GSDMD蛋白的表達，而雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)可抑制GSDMD蛋白的表達，并且此抑制作用隨雌二醇濃度的增加而增強。

已有大量的流行病學研究及臨床試驗證實雌激素對人晶狀體上皮細胞具有保護作用[7-8，21-22]。有研究表明雌激素對晶狀體上皮細胞保護作用主要是通過非基因組機制，與受體無關[23]。本研究組也曾發(fā)現(xiàn)雌二醇可通過上調端粒酶活性而抗人晶狀體細胞凋亡，且可通過激活SIRT1/P53通路抗凋亡發(fā)揮對人晶狀體上皮細胞的保護作用[24]。但目前尚無研究證實雌激素對人晶狀體上皮細胞的保護作用是否與抗焦亡相關。本實驗結果顯示，H2O2可誘導人晶狀體細胞的焦亡，而這種作用可被雌激素所抑制。并且這種抑制作用在一定范圍內(nèi)隨雌激素濃度的遞增而遞增。由此我們認為在年齡相關性白內(nèi)障的發(fā)生中可能同時存在細胞凋亡及細胞焦亡的相互作用，并且雌激素對晶狀體上皮細胞的保護作用不僅可通過抗氧化、抗凋亡等途徑，可能還有抗焦亡過程的參與。

綜上所述，本研究證明了17β-雌二醇對人晶狀體上皮細胞的保護作用具有濃度依賴性，且其保護機制與抑制晶狀體上皮細胞焦亡過程相關，并有經(jīng)典焦亡途徑參與。為雌激素對人晶狀體上皮細胞的保護作用機制提供新的研究方向，但雌激素的作用靶點及焦亡過程通路還需進一步探索。