董 賽,李國熊,方家恒,陳 鑫,孫倚天

董賽,李國熊,方家恒,陳鑫,孫倚天,杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市 310015

0 引言

胃癌(Gastric cancer,GC)是嚴(yán)重危害人類健康的最常見的惡性腫瘤之一.根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),2012年全球GC發(fā)病率位于惡性腫瘤發(fā)病率第5位、死亡率位于第3位[1].GC的發(fā)生經(jīng)過一系列胃粘膜病理變化,胃上皮內(nèi)瘤變(gastric intraepithelial neoplasia,GIN)是指基底膜以上上皮的一種非浸潤性腫瘤學(xué)改變,包括低級別胃上皮內(nèi)瘤變(low-grade gastric intraepithelial neoplasia,LGIN)和高級別上皮內(nèi)瘤變(high-grade gastric intraepithelial neoplasia,HGIN).根據(jù)專家共識意見,推薦在早期胃癌和HGIN狀態(tài)下及時(shí)通過ESD或EMR進(jìn)行干預(yù),能顯著減少GC的發(fā)生率以及改善GC預(yù)后.已知與GC相關(guān)的基因數(shù)目眾多,隨著研究深入,越來越多的基因被發(fā)現(xiàn),針對基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的靶向治療藥物也逐漸產(chǎn)生,如人表皮生長因子受體2 (HER-2)拮抗劑曲妥珠單抗、酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼.未來GC基因研究前景可觀,不僅可以發(fā)掘與GC相關(guān)的新基因,也可以研究基因與GC及GIN預(yù)后之間的相關(guān)性,預(yù)測GC及GIN的發(fā)生發(fā)展并且作為潛在靶點(diǎn)為GC的治療提供更多選擇.

1 Hhip基因與胃癌

人刺猬相互作用蛋白(human hedgehog-interacting protein,Hhip)基因位于染色體3q31.21-31.3,與人類多種腫瘤的發(fā)生相關(guān).Hhip基因的過表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲,Hhip基因的表達(dá)水平或可作為確定非小細(xì)胞肺癌分型及TNM分期的參考標(biāo)準(zhǔn)[2,3];早有研究[4]表明Hhip基因沉默與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、彌漫型胃癌TNM分期有關(guān),體外實(shí)驗(yàn)中,下調(diào)Hhip基因的表達(dá)水平可顯著增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和侵襲能力.近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Hhip作為Hh信號通路的負(fù)性調(diào)控基因,通過抑制Hh信號通路的激活,保持通路的穩(wěn)定,從而抑制GC的發(fā)生發(fā)展.

1.1 Hhip基因與Hh信號通路的相關(guān)性及其分子機(jī)制 多項(xiàng)研究顯示,Hh信號通路的激活與人類多種腫瘤的形成有關(guān),如胃癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等[5-7].Hh信號通路涉及的成分包括三種Hh配體:SHH (Sonic hedgehog)、IHH (Indian hedgehog)、DHH (Desert hedgehog)及跨膜受體PTCH1 (Patched1)、G-蛋白偶聯(lián)受體SMO(Smoothed)、負(fù)性調(diào)節(jié)分子SUFU (Suppressor-of-fused)和轉(zhuǎn)錄因子GLI (Glioblastoma-associated-protein)家族等.在非配體狀態(tài)下,PTCH1受體被主動抑制,阻止激活劑SMO進(jìn)入初級纖毛,GLI蛋白被磷酸化后部分降解,產(chǎn)生GLI阻遏物形式(GLIR),關(guān)閉Hh靶基因的表達(dá).當(dāng)配體存在時(shí),PTCH1的抑制作用被解除,使Hh信號通路激活,激活過程如圖1所示[8].三種Hh配體通過結(jié)合跨膜受體PTCH1激活相同的信號級聯(lián),但這些配體的分布呈現(xiàn)組織特異性,SHH和IHH主要在胃腸道內(nèi)表達(dá),而DHH的表達(dá)僅限于睪丸和神經(jīng)系統(tǒng)[8].SHH在人類多種消化系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)上調(diào),如胃癌、結(jié)直腸癌,導(dǎo)致Hh信號通路異常激活[9,10].SHH與跨膜受體PTCH1結(jié)合后通過七次跨膜蛋白SMO傳導(dǎo)信號至細(xì)胞內(nèi),使轉(zhuǎn)錄因子GLI從KIF7和SUFU中解離,轉(zhuǎn)錄激活因子(GLIs)進(jìn)入細(xì)胞核,誘導(dǎo)多種靶基因的表達(dá).靶基因包括Ptch1、Ptch2及Gli1,其表達(dá)增加是激活信號通路的一個(gè)高度可靠的指標(biāo),Ptch1和Gli1表達(dá)產(chǎn)物分別通過負(fù)反饋和正反饋回路機(jī)制調(diào)控Hh信號通路;其他靶基因包括Hhip、Ccnd2、Bcl2、Mycn等以及Wnt信號通路成員,這些靶基因的激活和失活可能參與了正常組織和器官的發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生[8,11].HHIP是一種Ⅰ型膜糖蛋白,由4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成,被認(rèn)為是三種Hh配體SHH、IHH、DHH的潛在拮抗劑,可以與PTCH1受體競爭性結(jié)合三種Hh配體,通過負(fù)反饋機(jī)制抑制Hh信號通路的激活[12].

圖1 Hh信號通路激活過程.

Hh信號通路涉及多種發(fā)育和生理過程,在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用.在成人胃中,Hh信號通路不僅調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的分化和成熟,而且在胃的生理活動中也是必不可少的.正常胃粘膜上皮細(xì)胞分泌SHH,被基質(zhì)細(xì)胞上的受體識別,從而啟動Hh信號級聯(lián),增加下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,這就是所謂的“旁分泌”調(diào)控.在GIN中,這種“旁分泌”調(diào)節(jié)的平衡被打破,SHH表達(dá)增加,刺激Hh信號通路過度激活,從而導(dǎo)致化生轉(zhuǎn)化和纖維組織的生長,進(jìn)而發(fā)生癌變.在GC胃粘膜組織中,除了“旁分泌”調(diào)節(jié)外,“自分泌”調(diào)節(jié)也有助于癌癥的進(jìn)展,GC細(xì)胞SHH的表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步激活Hh信號通路,促進(jìn)GC的發(fā)生發(fā)展[8].幽門螺桿菌感染正常胃粘膜后,可直接控制SHH的分泌,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCS)被招募到慢性炎癥部位,重新填充胃上皮細(xì)胞,促進(jìn)胃粘膜正常細(xì)胞向異型增生轉(zhuǎn)變[13].

1.2 Hhip基因表達(dá)水平與GIN及GC預(yù)后的相關(guān)性 Sun等[14]對95例GC、癌旁正常胃粘膜組織及29例GIN患者的胃粘膜組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)Hhip基因在GC組織中的表達(dá)水平顯著降低,在GIN組織中的表達(dá)水平低于相鄰正常胃粘膜組織,但高于GC組織樣本;Hhip基因表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.041)、神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(P=0.001)、TNM分期(P=0.007)呈負(fù)相關(guān);此外,Hhip基因表達(dá)水平較高的GC患者總生存期(overall survival,OS)與無病生存期更長,是GC患者OS的獨(dú)立預(yù)測因子(P<0.01).另有研究[15]通過PT-PCR法檢測52對GC組織和相應(yīng)的癌旁正常組織中的Hhip基因表達(dá)水平,也得到了類似結(jié)果;隨訪3年發(fā)現(xiàn),GC患者中Hhip基因表達(dá)水平雖與局部復(fù)發(fā)無相關(guān)性(P=0.58),但與GC轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P=0.035).上述研究表明,從正常胃粘膜發(fā)展到GIN最后成為GC的過程中,Hhip基因的表達(dá)水平逐漸下降,相對低表達(dá)的GC患者預(yù)后較差,其或許能預(yù)測GIN的發(fā)生發(fā)展及GC預(yù)后.

1.3 抑制Hhip基因啟動子甲基化是治療GC的潛在新靶點(diǎn) Song等[15]通過構(gòu)建病毒Hhip表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞株,使GC細(xì)胞HHIP蛋白水平升高,對轉(zhuǎn)染后的GC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖和Transwell實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)GC細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降;采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSPCR,MSP)法分析GC細(xì)胞啟動子甲基化水平,結(jié)果顯示被病毒Hhip表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的GC細(xì)胞啟動子CpG島甲基化比例為13.85%,顯著低于未被轉(zhuǎn)染的GC細(xì)胞.在一項(xiàng)研究中[16],對30例GC及癌旁正常組織的手術(shù)標(biāo)本采用MSP法進(jìn)行Hhip基因啟動子甲基化水平檢測,結(jié)果表明GC組織Hhip基因啟動子甲基化水平顯著高于癌旁正常組織,啟動子甲基化水平與Hhip基因mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(P=0.000).藥物5-氮雜胞苷(5-aza-dc)是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,能有效抑制DNA甲基化水平.用不同濃度的5-aza-dc干預(yù)GC細(xì)胞,均能使GC細(xì)胞增殖活力顯著降低,凋亡率升高,其最佳劑量為2.0 μm (P=0.000);5-aza-dc干預(yù)后GC細(xì)胞的Hhip mRNA及HHIP蛋白水平顯著高于未干預(yù)組.因此,抑制Hhip基因啟動子甲基化水平可上調(diào)Hhip基因的表達(dá),抑制GC細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)GC細(xì)胞的凋亡.目前已有研究[8]認(rèn)為Hh信號通路涉及的某些分子是GC的治療靶點(diǎn),如抗SHH單克隆抗體5E1通過結(jié)合假活性位點(diǎn)阻斷Hh信號通路,環(huán)巴胺衍生物IPI-92直接與SMO的蛋白螺旋體結(jié)構(gòu)結(jié)合而使其失活,Hhip基因啟動子序列或許也可以成為GC治療的潛在新靶點(diǎn).

2 溶血磷脂酸受體2基因與GC

溶血磷脂酸受體2 (Lysophosphatidic acid receptor 2,Lpar2)基因位于染色體19p12,其編碼的LPA2是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體,由348個(gè)氨基酸組成,分子量約為39 kDa,屬于內(nèi)皮分化基因受體(EDG)家族[17,18].研究表明,LPA2與人類許多腫瘤相關(guān),LPA2與其配體LPA結(jié)合可激活LPA信號通路,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化,如乳腺癌中LPA2受體表達(dá)水平高提示預(yù)后不良[19],肝癌中Lpar2 mRNA的高表達(dá)與癌細(xì)胞低分化有關(guān)[20],結(jié)腸癌細(xì)胞中 LPA2受體的高表達(dá)促進(jìn)了耐藥性的獲得,促使抗癌藥物失效[21].

2.1 Lpar2基因表達(dá)產(chǎn)物與ATX-LPA信號軸及其分子機(jī)制 近年來的研究表明,LPA2受體與異三聚體G蛋白Gi/o、Gq/11和G12/13家族結(jié)合,這些G蛋白通過Ras、Rac、PI3K、MAPK、PLC、二?；视头肿拥葐酉掠涡盘柾?這些信號通路與腫瘤的存活、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[22].Yamashita等[23]通過免疫組織化學(xué)方法檢測204例GC組織中LPA2受體的表達(dá)水平,結(jié)果顯示LPA2受體在腸型癌中優(yōu)先表達(dá)(67%),明顯高于彌漫型癌(32%);此外,彌漫型癌中LPA2受體的表達(dá)水平提高了癌細(xì)胞的淋巴管浸潤率(P=0.0421)、靜脈浸潤率(P=0.0023)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P=0.0159),而在腸型癌中未發(fā)現(xiàn)兩者有顯著相關(guān)性,表明LPA2的表達(dá)水平可能與彌漫型癌的腫瘤分期(T1-4)呈正相關(guān).Zhang等[24]的研究結(jié)果表明ATX-LPA信號軸通過PI3K/Akt和MAPK/ ERK介導(dǎo)的機(jī)制誘導(dǎo)骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的表達(dá),OPN是一種細(xì)胞因子,在細(xì)胞粘附、趨化、凋亡、侵襲和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用,OPN在ATX-LPA軸誘導(dǎo)的GC細(xì)胞遷移中是不可或缺的,它能保護(hù)GC細(xì)胞躲避紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡.

ATX-LPA信號軸的激活與多種腫瘤相關(guān),如甲狀腺癌、乳腺癌[25,26].溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一種生物活性磷脂,在細(xì)胞膜合成過程中產(chǎn)生,是存在于所有真核生物組織和血漿中的強(qiáng)大的細(xì)胞外信號分子.細(xì)胞外合成LPA有一個(gè)主要途徑,在該途徑中,磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺等前體分子分別通過磷脂酶A1 (PLA1)和磷脂酶A2 (PLA2)作用產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)和溶血磷脂酰乙醇胺,然后在自身毒素(ATX)作用下轉(zhuǎn)化為LPA.ATX被認(rèn)為是ATX-LPA信號軸的守門人,在信號傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用[18],抑制ATX活性可影響ATXLPA信號軸的激活,從而消除LPA對細(xì)胞存活和遷移的大部分影響[27].ATX-LPA信號通過至少6個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體(LPA1-6)來轉(zhuǎn)導(dǎo),LPA與受體結(jié)合后介導(dǎo)許多生物學(xué)活動.在腫瘤細(xì)胞中,ATX-LPA信號被放大和控制,以支持自身的生長和轉(zhuǎn)移,這可能是通過增加ATX或LPA受體的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的.ATX-LPA信號傳導(dǎo)可被磷酸脂質(zhì)磷酸酶(LPPs)終止,所以細(xì)胞外LPA的動態(tài)平衡主要是由ATX與LPPs來調(diào)控.LPA-ATX信號不僅可以刺激腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,還能通過保護(hù)癌細(xì)胞免受細(xì)胞毒性藥物和照射所造成的損傷,在形成抗癌藥物耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28].然而,對于Lpar2及ATX-LPA信號軸在GC發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

2.2 Lpar2基因表達(dá)水平與GIN及GC預(yù)后的相關(guān)性Zhang等[29]對51例GC、21例GIN組織及13例正常人胃粘膜組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn),不同分化程度的GC組織LPA2受體陽性率不同,其中低分化為89.5%,中分化為81.3%、高分化為25%;LGIN的陽性率為25%,HGIN的陽性率為33.3%,正常胃粘膜的陽性率23.1%,各組之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;通過實(shí)時(shí)聚合酶璉反應(yīng)(PCR)法檢測Lpar2 mRNA在GC和GIN組織中的表達(dá)水平,結(jié)果分別為0.045±0.018和0.021±0.009,差異有顯著性;根據(jù)年齡、Lauren分型等不同臨床特征對51例GC患者進(jìn)行分組,分別比較各組內(nèi)LPA2受體陽性率,發(fā)現(xiàn)其與GC的浸潤深度、Lauren分型、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)(P<0.05),且浸潤深度深、臨床分期晚、存在血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者LPA2受體陽性率更高.上述研究顯示,從正常胃粘膜發(fā)展到GIN,最后進(jìn)展為GC的過程中,LPA2受體的表達(dá)陽性率逐步提升,低分化的GC患者受體陽性率更高,提示LPA2受體陽性的GIN患者或許更有可能進(jìn)展為GC,LPA2受體水平較高的GC患者預(yù)后不良.

2.3 Lpar2基因是治療GC的潛在新靶點(diǎn) 上皮細(xì)胞間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程,E-cadherin為上皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物,Vimentin為間葉細(xì)胞的分子標(biāo)志物,間質(zhì)化的上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)降低,Vimentin表達(dá)升高,從而具備游走遷移和浸潤能力,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用.馬琳娜等[30]用Lpar2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 SGC-7901 GC細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)隨著LPA2的水平增加,E-cadherin的表達(dá)逐漸降低,Vimentin的表達(dá)逐漸升高,提示 LPA2參與了GC細(xì)胞的EMT過程,LPA2水平增加后的GC細(xì)胞更加容易轉(zhuǎn)移;Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)顯示GC細(xì)胞的侵襲和遷移能力隨著 LPA2水平增高而增強(qiáng);通過細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),如上調(diào)LPA2受體水平,GC細(xì)胞的凋亡能力降低,增殖能力增強(qiáng)(P<0.05).上述研究表明,若能尋找到一種有效的藥物抑制Lpar2基因的表達(dá),進(jìn)而抑制GC細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡,或許又是一個(gè)GC治療的潛在新靶點(diǎn).

3 Hh信號通路與ATX-LPA信號通路之間的相關(guān)性

目前尚未見研究報(bào)道Hhip基因與Lpar2基因之間存在聯(lián)系,但兩者參與的信號傳導(dǎo)通路可能存在交聯(lián)關(guān)系,影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展.有研究發(fā)現(xiàn),Hh信號通路和參與調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的PI3K/Akt通路相互激活、促進(jìn),共同參與GC細(xì)胞的EMT過程,加速GC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[31];另外,Hh信號通路效應(yīng)蛋白GLI1也可以直接激活多種細(xì)胞功能基因的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物包括SNAI1蛋白和OPN[8],其中SNAI1作為EMT多種信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子,與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[32];Po等[33]發(fā)現(xiàn)在肺癌中GLI1可以通過MAPK/ERK信號途徑激活,多種機(jī)制誘導(dǎo)觸發(fā)MAPK/ERK/GLI1級聯(lián)反應(yīng),包括KRAS突變.另有研究報(bào)道ATX-LPA信號通路與PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路也存在交聯(lián)關(guān)系,誘導(dǎo)OPN的表達(dá),加速GC細(xì)胞遷移[24];LPA2受體可以激活MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游因子Ras,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和存活,在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[22];同時(shí)LPA2受體也參與GC細(xì)胞的EMT過程[30].Hh信號與ATXLPA信號通路之間或許存在更多的交聯(lián)關(guān)系,對GC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化和耐藥產(chǎn)生影響,有待進(jìn)一步研究探討.

4 展望

綜上所述,在GC的發(fā)生發(fā)展過程中,Hhip和Lpar2基因的表達(dá)分別發(fā)揮著抑制和促進(jìn)的作用;GIN胃粘膜組織中Hhip基因的表達(dá)水平低于正常胃組織但高于GC組織,Lpar2基因的表達(dá)水平與之恰為相反;GC患者的預(yù)后與Hhip基因表達(dá)水平呈正相關(guān),與Lpar2呈負(fù)相關(guān).因此,聯(lián)合檢測Hhip和Lpar2的表達(dá)水平有望預(yù)測GIN的發(fā)生發(fā)展和GC的預(yù)后,Hhip與Lpar2也是GC治療潛在的新靶點(diǎn),為臨床診治提供新思路.但LGIN和HGIN胃黏膜組織的Hhip及Lpar2基因表達(dá)水平是否均存在差異,以及是否可以此評估LGIN發(fā)展為HGIN的風(fēng)險(xiǎn)程度,早期對高風(fēng)險(xiǎn)的LGIN患者進(jìn)行內(nèi)鏡下治療,尚需進(jìn)一步探索.