陳靜妮，代禮平，雷 燕，胡海浩，黃鑒濤，簡紀常，閆秀英

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室/水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088;2.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東 廣州 510515）

先天性免疫應(yīng)答是宿主防御病毒感染的第一道屏障，并可激起宿主的獲得性免疫反應(yīng)[1]。在魚類抗病毒感染的主要免疫應(yīng)答中，細胞免疫起重要作用。魚類免疫細胞包括非特異性細胞毒性細胞（nonspecific cytotoxic cell,NCC）、淋巴細胞和吞噬細胞等。魚類NCC 的功能與哺乳動物自然殺傷（natural killer,NK）細胞相似。通過裂解病毒感染的細胞、寄生蟲、腫瘤靶細胞等，NCC 在魚體免疫反應(yīng)中有重要作用[2]。非特異性細胞毒性細胞受體蛋白-1（non-specific cytotoxic cell receptor protein 1，NCCRP-1）是NCC 發(fā)揮功能的分子基礎(chǔ)。有些魚類的NCCRP-1 是一種典型的Ⅲ型膜蛋白，有的是可溶性蛋白[3]。NCCRP-1 對NCC 的激活有識別、結(jié)合靶細胞，激活JAK/STAT 信號通路[7-8]等多重作用[4-6]，因而在硬骨魚NCC 免疫反應(yīng)中扮演重要角色[2,9]。在草魚（Ctenopharyngodon idella）抗呼腸孤病毒（GCRV）感染中，腎臟是重要免疫器官，草魚NCCRP-1 參與了免疫反應(yīng)[3]。

白細胞介素-10（interleukin 10,IL-10）是一種主要的抗炎因子，可抑制單核細胞、巨噬細胞等釋放炎癥介質(zhì)，并可增強抗炎性因子釋放，有下調(diào)炎癥反應(yīng)等作用[10]，魚類單核細胞、T 細胞、巨噬細胞等多種細胞可產(chǎn)生IL-10。在人類、動物、魚類等均已發(fā)現(xiàn)，IL-10 在疾病中起重要作用[11-13]；IL-10可參與病毒致病過程[14-20]。魚類IL-10 參與免疫調(diào)節(jié)，在鯉（Cyprinus carpio）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）等頭腎中的表達量最高[21-22]，在卡特拉鲃（Catla catla）各組織均有不同程度的表達，感染后2 d 達到表達高峰[23]。

為探索細胞免疫在草魚抗病毒感染中的作用，本研究對草魚NCCRP-1和IL-10進行原核表達，制備其多克隆抗體，探討在重組NCCRP-1 和IL-10 免疫后，草魚腎臟和腸[3,24]組織病理學(xué)變化及NCCRP-1和IL-10 的表達，為開發(fā)草魚出血病新型基因工程疫苗、新型免疫佐劑及免疫治療等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

載體pMD18-T，原核表達載體pET-32a，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21 購自TaKaRa 公司。成年新西蘭兔，2～ 5 kg/只，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（實驗動物質(zhì)量合格證：0001906），按常規(guī)方法喂以飼料、胡蘿卜和青菜。草魚200 尾（約250 g），取自廣東省湛江市鶴地水庫，隨機取目測健康的草魚10 尾，經(jīng)顯微鏡、PCR 和RT-PCR 等檢測無任何病原體和疾病癥狀，認為實驗魚健康。實驗魚于水箱26 ℃下暫養(yǎng)2 周，水體溶解氧、氨、氮和pH 分別是8.1 mg/L、0.1 mg/L、0.03 mg/L 和7.5。

1.2 草魚NCCRP-1 和IL-10 的原核表達與純化

根據(jù)本課題組前期獲得的草魚NCCRP-1和IL-10基因序列（GenBank 登錄號為HQ388293 和HQ388294）[3]，設(shè)計含酶切位點的引物（表1），用于擴增NCCRP-1和IL-10的ORF。取草魚腎臟組織，提取基因組DNA，用PCR 技術(shù)獲得草魚NCCRP-1和IL-10的ORF。PCR 擴增體系25 μL，含DNA 模板2 μL、10 μmol/L 引物各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL、10×ExTaqBuffer 2.5 μL、ExTaq酶 (1 U/μL) 0.25 μL、ddH2O 16.25 μL。草魚NCCRP-1ORF 擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃下延伸10 min，4 ℃條件下保存。草魚IL-10ORF 擴增條件除退火溫度為52 ℃外，其余同NCCRP-1。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

原核表達方法參照文獻[25]，將草魚NCCRP-1和IL-10的ORF（含酶切位點）插入pET-32a(+)載體（含his 標簽），通過菌落PCR、雙酶切（BamH I 和SalI）和測序確定正確構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-NCCRP 和pET-IL10。

將重組表達質(zhì)粒pET-NCCRP 和pET-IL10 分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，挑取生長良好的單菌落接入含50 μg/mL 氨芐的LB 液體培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min 條件振蕩培養(yǎng)12 h，按體積比1∶100 的比例接種到新配制的LB 液體培養(yǎng)基（含氨芐）中，在37 ℃下培養(yǎng)至D(600 nm) 達0.4～ 0.6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，在37 ℃下振蕩培養(yǎng)4 h，以10 000 r/min離心 2 min，收集菌體，通過聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳檢測蛋白表達情況，并進一步優(yōu)化重組融合蛋白NCCRP-1 和IL-10 的表達條件。

將含重組表達質(zhì)粒（pET-NCCRP 和pET-IL10）的BL21 菌分別接種于200 mL LB 液體培養(yǎng)基（含氨芐）中，經(jīng)最優(yōu)誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)，經(jīng)過多重離心和重懸，用8 mol/L 尿素在4 ℃下溶解表達的重組蛋白。將獲得的重組蛋白用HisTrap HP 柱按常規(guī)方法純化，分別用30、60、90、120、150、200、250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，收集逐步洗脫后的融合蛋白，然后進行SDS-PAGE 電泳和轉(zhuǎn)膜，用含50 g/L脫脂牛奶和質(zhì)量分數(shù)0.1%吐溫的硫酸鹽緩沖液（PBS）室溫下阻斷1 h，用抗-His 鼠抗（1∶1 000，Invitrogen）4 ℃下孵育16 h，再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（1∶3 000，Takara）孵育2 h，曝光顯影。按照Bradford 蛋白質(zhì)定量測定試劑盒（上海生工生物工程有限公司，貨號C503031）測定蛋白濃度。

1.3 兔抗草魚NCCRP-1 和兔抗草魚IL-10 多克隆抗體的制備及其效價測定

兔抗血清的制備參考文獻[25]，陰性對照血清取自未免疫兔。分別將純化后的重組NCCRP-1和IL-10蛋白 (500 μg) 與完全弗氏佐劑 (Sigma) 混勻呈乳狀，在兔后背采用多點注射法將此乳化混合物注入體內(nèi)。第1 次免疫2 周后，每兩周加強免疫1 次，共進行4 次加強免疫。最后1 次加強免疫后8 d，抽取兔子血液，用辛酸-硫酸銨法純化血清[26]，儲存在-20 ℃冰箱備用。用ELISA 方法[25]測定兔抗血清滴度，并采用Western blot[25]檢測抗原抗體結(jié)合特異性。

1.4 草魚免疫、攻毒和樣品準備

將暫養(yǎng)的實驗魚分為4 組，每組30 尾，其他草魚備用。對照組1：不進行免疫和攻毒；實驗組1：每尾注射200 μL 免疫混合液1（含24 μg 重組NCCRP-1 的質(zhì)量分數(shù)0.7%生理鹽水與弗氏完全佐劑體積比為4∶1）；實驗組2：每尾注射200 μL 免疫混合液2（含24 μg 重組IL-10 的質(zhì)量分數(shù)0.7%生理鹽水與弗氏完全佐劑體積比4∶1）；對照組2：每尾注射200 μL 佐劑混合液（質(zhì)量分數(shù)0.7%生理鹽水與弗氏完全佐劑體積比4∶1）。免疫后24 h 用約2 000 μg/mL GCRV GD108 對實驗組1、實驗組2 和對照組2 進行攻毒感染，劑量為150 μL/尾[25]。感染7 d 后，每組隨機取草魚3 尾，分別剖取腎臟和腸道組織，進行定量PCR、Western blot 和病理切片制作。

1.5 定量PCR 和Western blot

將3 尾草魚部分腎臟和腸道組織分別混合，提取RNA，進行定量PCR，重復(fù)3 次。定量PCR 內(nèi)參基因為β-actin和GAPDH，引物為actinF、actinR、GAPDHF 和GAPDHR（表1）。目的基因NCCRP-1和IL-10的定量PCR 引物為NCCRPF、NCCRPR、IL-10F 和IL-10R（表1）。定量PCR 體系（25 μL）：SYBR?Premix ExTaqTM12.5 μL，每條引物0.5 μL(10 pmol/L)，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 10 s、55 ℃（IL-10，54 ℃）30 s，40 個循環(huán)。用2-ΔΔCt法[27]處理定量PCR 數(shù)據(jù)，進行配對t檢驗，用SPSS15.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜ 0.05 時有顯著差異。

用預(yù)冷的質(zhì)量分數(shù)0.7%生理鹽水快速洗滌摘取的部分腎臟和腸道組織，快速放入液氮，然后于冰上進行超聲勻漿（避免起泡），勻漿時加入預(yù)冷的生理鹽水4.5 mL。組織勻漿中迅速加入預(yù)冷的100 μL 尿素緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；8 mol/L 尿素）和1 μL 蛋白酶抑制劑PMSF，反復(fù)吹打，細胞充分裂解后以4 ℃、12 000g條件離心10 min，收集上清液保存于-80 ℃。采用Bradford蛋白質(zhì)定量測定試劑盒測定總蛋白濃度，確保SDS-PAGE 電泳上樣蛋白總量一致。對腎臟和腸道中的NCCRP-1 和IL-10 進行Western blot 檢測[25]，一抗為上述的抗血清和兔抗GAPDH（1∶5 000，Thermo Fisher，上海），二抗為山羊抗兔（1∶30 000，Takara，大連）。孵育抗體時先進行目的蛋白的抗體孵育、顯色和檢測，然后使用Strip 緩沖液洗去膜上抗體，再進行內(nèi)參蛋白GAPDH 的抗體孵育、顯色和檢測。

1.6 組織病理切片制作

分別取草魚部分腎臟和腸道組織，用質(zhì)量分數(shù)0.7%的生理鹽水清洗，于Bouin 氏固定液中固定8 h，用流水洗去固定液。使用不同濃度的乙醇逐級脫水，按常規(guī)石蠟法[28]包埋切片，厚度5～ 6 μm；采用HE 染色、中性樹膠封片。用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理切片并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚NCCRP-1 和IL-10重組蛋白的表達與純化

草魚NCCRP-1的ORF 為714 bp (GenBank 登錄號HQ388293)，編碼237 個氨基酸，預(yù)測其分子質(zhì)量7.3 ku，等電點為5.63。草魚IL-10的ORF 為540 bp (GenBank 登錄號HQ388294)，編碼179 個氨基酸，預(yù)測其分子質(zhì)量為21.0 ku，等電點為8.34。

草魚NCCRP-1和IL-10的ORF 與表達質(zhì)粒pET-32a 連接后，重組表達質(zhì)粒pET-NCCRP 和pET-IL10 經(jīng)菌落PCR 鑒定、雙酶切鑒定（圖1）和測序驗證，重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 重組表達質(zhì)粒 pET-NCCRP 和pET-IL10 雙酶切Fig.1 Enzyme restriction of the recombinant expression plasmid pET-NCCRP and pET-IL10

重組表達質(zhì)粒pET-NCCRP 和pET-IL10 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 的最優(yōu)表達條件分別為0.1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h、1.0 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)6 h。重組表達質(zhì)粒pET-NCCRP 表達的融合蛋白分子質(zhì)量為47.8 ku（含融合標簽分子質(zhì)量20.5 ku）（圖2）；含空質(zhì)粒pET-32a 的BL21 菌體誘導(dǎo)后表達出20.5 ku 的融合標簽；未經(jīng)誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒pET-32a和重組表達質(zhì)粒pET-NCCRP 的BL21 菌體均未表達出目的蛋白（圖2）。重組表達質(zhì)粒pET-IL10 表達的融合蛋白分子質(zhì)量為41.5 ku（含融合標簽分子質(zhì)量20.5 ku）（圖2）；含空質(zhì)粒pET-32a 的BL21菌體誘導(dǎo)后表達出20.5 ku 的融合標簽；未經(jīng)誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒pET-32a 和重組表達質(zhì)粒pET-IL10 的BL21 菌體均無表達出目的蛋白（圖2）。表達的融合蛋白經(jīng)純化、不同濃度的咪唑緩沖液洗脫和電泳檢測（圖3），發(fā)現(xiàn)200 mmol/L 咪唑的純化效果最佳，純化后重組蛋白NCCRP-1 和IL-10 質(zhì)量濃度分別為690、520 μg/mL。

圖2 pET-NCCRP 和pET-IL10 在大腸桿菌中的表達Fig.2 Expression of pET-NCCRP and pET-IL10 in E.coli BL21

圖3 pET-NCCRP 和pET-IL10 重組蛋白的純化Fig.3 Purification of recombinant proteins pET-NCCRP and pET-IL10

2.2 兔抗草魚NCCRP-1 和IL-10 多克隆抗體效價

ELISA 檢測表明，NCCRP-1 和IL-10 均產(chǎn)生1∶40 000 的高效價特異抗體。western-blot 結(jié)果表明，NCCRP-1 抗血清可與重組蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，在48 ku 處有印跡條帶（目的蛋白）（圖4）；IL-10抗血清也可與重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，在41 ku處有印跡條帶（目的蛋白）（圖4）。

圖4 融合蛋白NCCRP-1 和IL-10 的免疫印跡Fig.4 Western blot of the fusion proteins NCCRP-1 and IL-10

2.3 NCCRP-1 和IL-10 在腎臟和腸中的表達

免疫和感染后，NCCRP-1 和IL-10 在mRNA和蛋白水平檢測結(jié)果見圖5、6。圖5 表明，在腎臟和腸中，實驗組1 NCCRP-1 表達量最大，且實驗組1 與其他組差異顯著（P＜ 0.05）；實驗組1 與對照組1、對照組2 的表達也有顯著差異；NCCRP-1 在腎臟中表達量比腸中高。Western blot 結(jié)果（圖5）也可證明NCCRP-1 表達的差異。IL-10 定量PCR、Western blot 結(jié)果（圖6）表明，在腎臟和腸中，實驗組2 的表達高于其他組，但無顯著差異（P＞ 0.05）。

圖5 NCCRP-1 在腎臟和腸中的表達Fig.5 Expression of NCCRP-1 in kidney and intestine

圖6 IL-10 在腎臟和腸中的表達Fig.6 Expression of IL-10 in kidney and intestine

2.4 組織病理學(xué)觀察

圖7 為部分病理切片結(jié)果。對照組1（未免疫未攻毒）草魚腎臟和腸無病理變化；實驗組1（重組NCCRP-1 免疫和GCRV GD108 攻毒）草魚腎小管上皮基部輕微水腫，腎臟和腸輕微出血；實驗組2（重組IL-10 免疫和GCRV GD108 攻毒）草魚腎小管上皮水腫，有淋巴細胞散在壞死，腎臟和腸固有層出血；對照組2（未免疫和GCRV GD108 攻毒）草魚腎臟出血，腎小管上皮基部水腫，腎小管上皮有紅色團塊，腸固有層嚴重出血和散在細胞壞死?？梢?，NCCRP-1 免疫組、IL-10 免疫組、未免疫組的組織出血程度由輕變重、壞死從無到有、水腫程度由輕到重，即組織病理變化逐漸嚴重，因此，重組NCCRP-1 和重組IL-10 免疫對草魚抗GCRV GD108 感染有一定效果；而重組IL-10 免疫后草魚出血和水腫程度介于NCCRP-1 免疫組和未免疫組之間，因此免疫效果不顯著。

圖7 草魚腎臟和腸的組織病理切片F(xiàn)ig.7 Pathological sections of kidney and intestine of grass carp

續(xù)圖7（Continued）

3 討論

細胞免疫是魚類防御病毒感染的重要防線。NCCRP-1 和IL-10 在不同細胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究成功對草魚NCCRP-1和IL-10基因進行原核表達，純化獲得目的蛋白，制備高效價的免疫血清，并通過組織病理切片和表達變化分析NCCRP-1 和IL-10 在抗病毒感染中的作用。

草魚感染GCRV 后，NCCRP-1在各組織中表達量均上調(diào)，在腎臟中上調(diào)最大，在腸中次之[3]。GCRV GD108 基因型屬于GCRV Ⅱ型，主要臨床癥狀是腸道出血，呈現(xiàn)“腸炎型”癥狀[3,8]。其感染草魚7 d 后，NCCRP-1在草魚腎臟中表達上調(diào)至峰值[3]。因此，本研究分析免疫草魚在感染GCRV GD108 7 d 時的腎臟、腸組織病理切片，以及NCCRP-1 和IL-10 表達。

組織病理學(xué)分析表明，用重組NCCRP-1 和重組IL-10 免疫對草魚抗GCRV GD108 感染有一定效果，重組NCCRP-1 免疫后病理變化較輕，Yan 等[3]的研究亦表明NCCRP-1 參與了抗GCRV 感染的免疫反應(yīng)；IL-10 在炎癥和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用[10]，但重組IL-10 免疫后病理變化較重，可能與GCRV 的致病機制等有關(guān)。

本研究表明，GCRV GD108 感染后，NCCRP-1表達在mRNA 和蛋白水平均上調(diào)（圖5），與其他研究[3,29]一致。Chaves-Pozo 等[29]研究表明，海鯛（Sparus aurata）和海鱸（Dicentrarchus labrax）感染野田村病毒（Viral nervous necrosis，VNN）后NCCRP-1的表達上調(diào)。NCCRP-1的表達上調(diào)與NCC 的殺傷機制相關(guān)[30]。NCCRP-1的表達可激活NCC，進而刺激細胞因子的釋放，裂解病毒感染的細胞[29-30]。本研究中，用重組NCCRP-1 免疫以及GCRV GD108 攻毒后，草魚NCCRP-1的表達量最大，推測外源NCCRP-1 可能誘導(dǎo)內(nèi)源性NCCRP-1的產(chǎn)生，NCCRP-1 也可能是良好的免疫增強劑，因而促進了草魚NCCRP-1的表達，從而增強草魚抵御病毒感染的免疫應(yīng)答。總之，從定量PCR、western blot 和組織病理學(xué)綜合分析可見，NCCRP-1 在草魚抗GCRV 感染過程中發(fā)揮著作用。關(guān)于魚類NCC和NCCRP-1 抵御病毒感染作用機制還有待深入研究。此外，細胞因子在抗感染方面有重要作用。外源重組細胞因子可在機體內(nèi)發(fā)揮免疫佐劑作用，已在許多病毒疫苗中發(fā)揮出良好的免疫增強作用，還可提高疫苗的保護率，提高機體對疫苗的免疫應(yīng)答，提高病毒蛋白的免疫原性等[31-32]。本研究中，重組NCCRP-1 也可能是作為外源重組細胞因子在GCRV 感染中發(fā)揮了作用。

IL-10 表達相對于NCCRP-1 上調(diào)不顯著，而且重組IL-10 免疫組（實驗組2）有較重的病理變化，說明其在GCRV 感染中抗病毒效果不明顯。雖然IL-10 有調(diào)節(jié)免疫平衡、釋放免疫介質(zhì)、抗原呈遞等作用[10]，且已發(fā)現(xiàn)IL-10 在病毒感染中發(fā)揮作用，如HPV (human papilloma virus) 感染后，在HPV E2、E6 和E7 的作用下IL-10的表達上調(diào)[19]，KSHV（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus）編碼的miR-K12-3 可減少IL-10 的表達來促進腫瘤的發(fā)展[20]，在大西洋鮭（Salmo salarL.）感染SAV(Salmonid alphavirus) 過程中IL-10表達上調(diào)[15]，鱖（Siniperca chuatsi）感染ISKNV（infectious spleen and kidney necrosis virus）后IL-10表達顯著上調(diào)[16]；但本研究中，免疫和攻毒后，草魚IL-10表達變化不顯著，或與草魚IL-10 的作用和炎性反應(yīng)相關(guān)。草魚IL-10 在GCRV 感染中的作用及GCRV 的感染機制有待進一步研究。

綜上，本研究對原核表達的草魚NCCRP-1 和IL-10 蛋白進行純化，制備兩者的高效價兔抗血清；重組NCCRP-1 和IL-10 免疫以及GCRV GD108 感染草魚后，草魚腎臟和腸組織病理切片分析，以及NCCRP-1、IL-10 的表達分析表明，外源NCCRP-1可能誘導(dǎo)內(nèi)源性NCCRP-1 的產(chǎn)生，也可能是作為良好的免疫增強劑而增強草魚抵御病毒感染的免疫應(yīng)答，因此，NCCRP-1 在草魚抗GCRV 感染過程中發(fā)揮作用；而IL-10 對GCRV 的抗感染作用不顯著，具體機制有待進一步研究。本研究可為開發(fā)草魚出血病新型基因工程疫苗、新型免疫佐劑等提供依據(jù)。