林 霞 楊曉俊 陳貴玲 張云霞 林海斌 謝?；?/p>

1 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院輸血科，福建省福州市 350001； 2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院； 3 福建省立金山醫(yī)院

類孟買血型是一類稀有的紅細胞血型。類孟買血型的特征是紅細胞可能與抗-A和(或)抗-B發(fā)生弱反應(yīng)或不反應(yīng)，與抗-H不發(fā)生反應(yīng)，血清中含有天然IgM型抗-H(I)，因此極易將類孟買人群的ABO血型誤定型為O型。本文通過3例罕見的AB型類孟買血型的鑒定，深入探討類孟買血型的血清學(xué)與分子生物學(xué)特征。

1 對象和方法

1.1 研究對象 患者1：肺腫物患者，女，66歲；患者2：乳腺癌患者，女，52歲；患者3：妊娠狀態(tài)，女，29歲。在3例患者血液標本進行血型鑒定時發(fā)現(xiàn)正定型O型，反定型AB型，正反定結(jié)果不一致,故各自采集EDTA-K2抗凝全血與唾液標本進行進一步血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測。

1.2 主要試劑與儀器 Erytra全自動血型分析儀、DG Gel ABO-CDE 卡、0.8%反定型 A1/B細胞 、抗人球蛋白卡、抗篩細胞(西班牙戴安娜公司)；單克隆抗-A、抗-B、抗-H、A1/B/O型標準紅細胞(上海血液生物醫(yī)藥有限公司)；人源抗-A和抗-B(自制,抗體效價>128,不含不規(guī)則抗體和冷凝集素)；基因組DNA提取試劑盒和人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血型血清學(xué)試驗。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[1]和相應(yīng)試劑使用說明書進行ABO血型鑒定(微柱法與試管法)、吸收放散試驗、唾液ABH 血型物質(zhì)檢測、不規(guī)則抗體篩查。

1.3.2 糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定[2]。(1)隨機挑選3人份O型獻血員紅細胞混合，用生理鹽水洗滌3次后，取壓積紅細胞40μl，加入400μl反應(yīng)液中[0.05mol/L 咪唑緩沖液(pH=6.5)、25mmol/L MnCl2、0.15mol/L NaCl、0.5%(質(zhì)量濃度)牛血清白蛋白各40μl；0.5mmol/L UDP-GalNAc 40μl(檢測A酶活性用)或0.5mmol/L UDP-Gal 40μl(檢測B酶活性用)；待檢血漿200μl]；37℃水浴4h(期間不時搖晃)后，再用生理鹽水洗滌3次，制得5%指示紅細胞懸液待用。(2)將單克隆抗-A和抗-B進行倍比稀釋(1∶1～ 1∶128)后待用。(3)取50μl 5%指示紅細胞懸液，與50μl不同稀釋度的抗-A、抗-B混合后，置室溫反應(yīng)20min，1 000r/min 離心30s，觀察凝集強度。血漿酶活性強度以發(fā)生凝集的抗體最高滴度來表示，并隨機選取A型、B型和O型各3人份獻血員的混合血漿作為陽性和陰性對照。

1.3.3 ABO基因分型。嚴格按照試劑說明書的操作流程提取樣本基因組DNA，采用ABO基因分型試劑盒(PCR-SSP法)進行ABO基因分型。

1.3.4 FUT1基因直接測序。根據(jù) FUT1基因參考序列(GenBank Accession Number NM-000148.4)設(shè)計FUT1 CDS區(qū)引物，正向測序引物為5’-GTCTAAACCTTTAACTTCCTCTT-3’，反向測序引物為5’-AAGATCAGGCTACTTCAGAA-3’，產(chǎn)物為1 270bp。引物合成、PCR擴增、直接測序均由福州尚亞生物技術(shù)有限公司協(xié)助完成。測序結(jié)果使用Chromas軟件進行序列比對分析。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)試驗結(jié)果 3例患者正定型O型，與抗-H無凝集。反定型AB型，與O細胞弱凝集，血漿中存在37℃無活性抗-H(I)。唾液中檢出A、B、H物質(zhì)?；颊?的吸收放散試驗結(jié)果顯示其紅細胞表面存在弱A、B抗原。結(jié)果詳見表1。3例患者卡式抗人球蛋白法不規(guī)則抗體篩查陰性。3例患者血清學(xué)表型均為ABmh。

表1 血型血清學(xué)鑒定結(jié)果

2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定結(jié)果 3例患者和AB型陽性對照組血漿均能在體外合成A抗原和B抗原，A酶和B酶活性均在1∶64～1∶128。

2.3 ABO基因分型(PCR-SSP法)結(jié)果 3例患者ABO基因PCR-SSP分型結(jié)果為AB型，見圖1。

圖1 3例患者的ABO基因PCR-SSP結(jié)果

2.4 FUT1基因直接測序結(jié)果 患者1和患者3的FUT1基因測序結(jié)果為h1h1型(551-552delAG的純合突變)，見圖2；患者2的FUT1基因測序結(jié)果為h1h2型(551-552delAG和881-882delTT的雜合突變)，見圖3。

圖2 患者1和患者3的FUT1基因直接測序結(jié)果

圖3 患者2的FUT1基因直接測序結(jié)果圖

3 討論

根據(jù)ISBT官網(wǎng)最新更新，目前人類一共發(fā)現(xiàn)39個血型系統(tǒng)，H血型系統(tǒng)是第18個血型系統(tǒng)。H血型系統(tǒng)只有一個H抗原，H抗原是ABO血型系統(tǒng)的前體物質(zhì)，受控于19號染色體上兩個緊密連鎖的基因位點：FUT1(H)基因和FUT2(Se)基因。FUT1基因編碼α1,2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化GDP-L-半乳糖上的巖藻糖基連接到前體分子末端半乳糖基的 C-2 位上，生成脂溶性H抗原，主要存在在人類紅細胞等細胞膜上，F(xiàn)UT2基因編碼α1,2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化1型前體生成可溶性H抗原，主要存在于體液、分泌液中[3]。孟買血型的FUT1基因型為hh，F(xiàn)UT2基因型為sese，故孟買血型紅細胞和分泌物中均缺乏H抗原；而類孟買血型的FUT1基因型為hh，F(xiàn)UT2基因型為 Se/Se 或 Se/se，因此類孟買血型只表現(xiàn)為紅細胞表面部分或完全缺失H抗原，其分泌液中有H物質(zhì)存在。目前，在我國尚未有孟買血型的出現(xiàn)，都是類孟買血型的報道。本文的3例患者均因正定型O型，反定型AB型，正反定結(jié)果不符進一步檢測發(fā)現(xiàn)其紅細胞與抗-H試劑不凝集，證實紅細胞表面幾乎無H抗原。血漿中存在IgM型抗-H(I)。對患者3進行吸收放散實驗，證實紅細胞表面弱A、B抗原的存在。在3例患者唾液中也檢測出A、B、H物質(zhì)。3例患者血漿均能在體外合成A抗原和B抗原，說明血漿中存在正?；钚缘腁糖基轉(zhuǎn)移酶和B糖基轉(zhuǎn)移酶，但因患者FUT1基因突變無法合成H抗原，所以體內(nèi)紅細胞表面無法表達A,B抗原。從以上血清學(xué)實驗均可證實患者ABO血型為AB型。

我國目前已報道的類孟買血型分布頻率，臺灣為1/8 000，福建為1/8 500，香港為1 /15 620，北京為1/102萬[4-5]，多分布于我國東南沿海地區(qū)。AB型類孟買的報道更為少見[6]。在中國人群中最常見的FUT1基因的突變類型是h1(551-552delAG)、h2(881-882delTT)、h3(658C>T)。2006年有文獻報道[4]福建地區(qū)人群發(fā)現(xiàn)的14例類孟買個體的FUT1基因分析，其中h1基因占67.85%，h2基因占25%，本次研究發(fā)現(xiàn)的3例類孟買血型，經(jīng)FUT1基因直接測序結(jié)果顯示2例患者為h1h1型突變，1例患者為h1h2型突變，筆者的結(jié)果與上述研究成果大體相近。根據(jù)ISBT官網(wǎng)提供的Names for H (ISBT 018) blood group alleles v5.1 170221數(shù)據(jù)顯示，截至目前已發(fā)現(xiàn)56種FUT1基因突變類型，按照基因結(jié)構(gòu)改變的類型分類可分為堿基置換51種、堿基缺失4種和堿基插入1種。在35種H抗原弱表達型FUT1基因突變中，33種為堿基置換(在我國發(fā)現(xiàn)報道過的c.235A>G[7]、c.293C>T[7]、c.328G>A[8]、c.424C>T[9]、c.649G>T[10]、c.658C>T[8]、c.661C>T[11]、c.682A>G[7])。由于FUT1基因某一位點發(fā)生核苷酸替換，造成相應(yīng)的編碼的氨基酸的替換，被替換的氨基酸可能是α1,2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性中心的重要組成部分，因此導(dǎo)致酶活性不同程度減低，H抗原部分缺失，正定時可與抗-A和(或)抗-B出現(xiàn)±～3+強度的凝集，但與抗-H不凝集。在21種H抗原完全缺失型突變中，3種為堿基缺失，如本文報道的h1型和h2型。由于堿基缺失，導(dǎo)致閱讀框架發(fā)生移碼，在氨基酸翻譯過程中提前出現(xiàn)終止密碼子，形成截短的α1,2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使酶活性大大減低，H抗原大量缺失，紅細胞上往往只表達微量的A或B抗原，常規(guī)血清學(xué)檢測中不能與單克隆抗-A或抗-B發(fā)生凝集，正定型表現(xiàn)為O型，其紅細胞表面的弱A、B抗原只能通過吸收放散實驗來證實。這些基因突變對α1,2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的影響需通過對FUT1基因的轉(zhuǎn)染表達后方可證實。FUT1和FUT2兩個基因位于19號染色體長臂上,相距僅35kb，具有70%的同源性[3]。FUT2基因的多態(tài)性呈現(xiàn)明顯的地域性和種族性的特點，在池泉等[4]研究中發(fā)現(xiàn)，福建地區(qū)h1 基因與Se357基因連鎖, h2基因與Se357,716基因連鎖,存在著h1-Se357和h2-Se357,716的單元型。本文所述的3例患者的FUT1與FUT2基因的連鎖關(guān)系有待進一步研究。

由于類孟買患者血漿中可能存在高效價的高頻抗體抗-H(I)，所以在正常獻血者中找到與患者配血相合的血液的可能性微乎其微。當類孟買患者需要輸血治療時，建議從患者家屬中尋找同是類孟買血型的家屬，或者聯(lián)系當?shù)氐难褐行膶ふ?。緊急情況下，選擇與患者配血主側(cè)凝集強度最弱的ABO同型的血制品，37℃保溫慢輸，嚴密監(jiān)控。