王琛瑤，梁百慧，吳錦源，唐梓涵，許小文，尹梓健，丁雅瓊，方雄釗，李栢芝，文姝佚，程轉(zhuǎn)，詹涵，張粵烽，王泫哲，何仕龍，張可洵，劉雅騏，周飛，熊興東，白春英，許麗艷，李恩民，

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東汕頭515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，廣東汕頭515041；3.赤峰學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024076；4.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808；5.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東潮州521041)

RAS相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)是Ras超家族中Rho亞家族的核心成員。人類的RAC1基因位于7號染色體短臂2區(qū)2帶1亞帶，含有兩個轉(zhuǎn)錄本。編碼RAC1蛋白的轉(zhuǎn)錄本長度為2 309 nt(NM_006908.5)，編碼192個氨基酸；編碼RAC1b蛋白的轉(zhuǎn)錄本長度為2 366 nt(NM_018890.4)，編碼211個氨基酸。RAC1和RAC1b是高度同源的剪接變體，剪接亞型RAC1b在1999年首次被描述，包括了1個額外的外顯子3b緊接在開關(guān)II區(qū)域后面，該外顯子中插入了19個氨基酸，這種插入導(dǎo)致其核苷酸交換率增強并且延遲GTP水解，因此，在大多數(shù)細胞中，RAC1b處于GTP結(jié)合的活性狀態(tài)，該剪切亞型可能不是肌動蛋白細胞骨架的直接調(diào)節(jié)因子，因此本文不予詳述。RAC1主要存在于細胞質(zhì)與細胞偽足處，這是RAC1蛋白參與細胞運動調(diào)控的形態(tài)學(xué)證據(jù)。RAC1是一種結(jié)構(gòu)簡單的GTP酶蛋白，其折疊方式由中心區(qū)域的β片層和周圍是α螺旋組成，RAC1含有1個核心的結(jié)構(gòu)域，即G結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有5個一致性元件，主要位于其β片層的C端以及α螺旋的連接處，該位置組成了核苷酸的結(jié)合位點，其前3個一致性元件(P-loop、開關(guān)Ⅰ、開關(guān)Ⅱ)與GTP和GDP的結(jié)合有關(guān)。RAC1的功能高度依賴于其GTP結(jié)合態(tài)和GDP結(jié)合態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。前者是活性態(tài)，相當于開關(guān)的開啟狀態(tài)，介導(dǎo)相關(guān)細胞信號傳導(dǎo)；后者是失活態(tài)，相當于開關(guān)的關(guān)閉狀態(tài)，阻斷相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RAC1蛋白的GTP結(jié)合態(tài)/活性態(tài)和GDP結(jié)合態(tài)/失活態(tài)之間的循環(huán)切換，受鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTPase激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)和GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)三者的協(xié)同調(diào)控。通常情況下，RAC1主要處于與GDP結(jié)合的失活態(tài)，而鎖定這種狀態(tài)主要依靠GDIs。當接收到激活信號時，非蛋白酪氨酸激酶SRC受體(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)催化GDIs與RAC1-GDP之間的解離；而失活態(tài)RAC1-GDP在GEFs的作用下會生成激活態(tài)RAC1-GTP；激活態(tài)RAC1-GTP在GAPs作用下水解，生成失活態(tài)RAC1-GDP。以上被稱為RAC1/GTPase循環(huán)，詳見圖1。

圖1 RAC1/GTPase循環(huán)

1 RAC1對惡性腫瘤細胞增殖的調(diào)控及其分子機制

細胞增殖是生命活動的基本特征。正常細胞的周期分為4期，G1期為DNA復(fù)制做準備，S期進行DNA復(fù)制，G2期為有絲分裂做準備，M期為有絲分裂期。在細胞周期中，G1期的啟動是關(guān)鍵。G1晚期有決定細胞周期的限制點，細胞需要接受生長因子的持續(xù)刺激，才能通過該限制點進入S期，否則進入相對靜止的G0期。這些生長因子的刺激信號會通過活化細胞膜酪氨酸激酶受體(receptor protein tyrosine kinase，RTKs)、RAC1/PI3K/AKT、RAC1-PAKs以及RAC1/JNK/c-Jun等信號通路將細胞增殖信號傳至細胞內(nèi)部。而腫瘤惡性增殖的核心事件是正常的細胞周期進程被破壞，上述相關(guān)調(diào)控蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，使腫瘤細胞接收一系列異常信號，順利通過細胞周期限制點，進入細胞周期進程，失去分化能力，發(fā)生惡性增殖。因此，長期以來有關(guān)細胞周期信號通路的研究，一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點。2018年發(fā)表的一項研究表明，激活胃癌細胞中的RAC1/PI3K/AKT通路可以通過影響細胞周期促進細胞增殖活力。2020年發(fā)表的研究表明，RAC1可以促進食管癌細胞的生存能力，在食管癌細胞中下調(diào)RAC1可以通過阻斷phosphoinositide 3-kinase/AKT/mTOR通路來抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移。最新研究報道，轉(zhuǎn)移性前列腺癌相關(guān)基因編碼蛋白DEPDC1B能通過與RAC1結(jié)合，激活PAK1通路，誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和促進細胞增殖，這種DEPDC1B介導(dǎo)的致癌作用可被RAC1-GTP抑制劑或

RAC1

基因沉默所逆轉(zhuǎn)，該研究提示RAC1可能作為臨床干預(yù)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的重要靶點。另有研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun能對組織發(fā)育和疾病的不同信號進行串擾、放大和整合。在細胞內(nèi)，c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控可通過RAC1/SAPK/JNK對c-Jun的Ser63/Ser73磷酸化實現(xiàn)，RAC1會通過干擾RAC1/SAPK/JNK/c-Jun信號的傳遞，阻斷正常細胞周期的進行，影響細胞的增殖。上述研究表明，抑制RAC1在腫瘤細胞中的異常過表達，能夠阻斷腫瘤細胞的惡性增殖。

2 RAC1對惡性腫瘤細胞遷移的調(diào)控及其分子機制

腫瘤細胞的遷移由4個步驟組成：頭部細胞絲狀偽足的形成和延伸以探測細胞運動的方向，緊接著細胞形成片狀偽足并建立新黏附位點提供細胞向前運動所需的黏附力，最后胞體的收縮，以及細胞尾部的退縮完成一個細胞的運動周期。腫瘤細胞通過重復(fù)此4個過程不斷向前遷移。在多條信號通路中，RAC1是關(guān)鍵的調(diào)控因子，處于中樞位置，主要參與對細胞骨架重組和細胞黏附基質(zhì)的調(diào)控，進而控制細胞的遷移過程。細胞形態(tài)改變和細胞偽足的形成是細胞侵襲遷移的起始步驟，RAC1可通過調(diào)控其下游效應(yīng)因子WASP(wiskott-aldrich syndrome protein，WASP)蛋白家族，誘發(fā)膜皺褶，促進片狀偽足形成。新形成的片狀偽足能與周圍基質(zhì)形成黏附連接，產(chǎn)生細胞向前運動的錨著位點。細胞遷移頭部高度動態(tài)性偽足結(jié)構(gòu)的形成依賴肌動蛋白單體聚合和肌動蛋白纖維的延長，WASP家族不同成員通過不同的結(jié)構(gòu)域與RAC1結(jié)合而被活化。細胞偽足的形成還依賴另一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Cofilin，Cofilin可使肌動蛋白絲被切割，產(chǎn)生新的肌動蛋白絲末端。RAC1通過與二聚化的PAKs(p21 activated kinases)分子的結(jié)合域PBD結(jié)合，恢復(fù)PAKs活性。見圖2，激活下游的效應(yīng)分子LIMK1/2(LIM domain kinase 1/2)，進一步磷酸化Cofilin，使Cofilin失活，抑制肌動蛋白絲被切割，穩(wěn)定肌動蛋白絲細胞骨架。新黏附位點的建立是細胞遷移的第2個步驟，細胞持續(xù)的遷移需依賴細胞偽足與細胞外基質(zhì)(extracellular metrax，ECM)的穩(wěn)定黏附，提供細胞向前遷移的牽引支點。遷移的細胞頭部與ECM的黏附，以及尾部與ECM的去黏附不斷交替使得細胞向前遷移，RAC1對這一過程發(fā)揮精確的調(diào)節(jié)作用。細胞表面的整合素受體與ECM中特異的配體結(jié)合，通過整合素聚集成簇而形成黏著斑復(fù)合物(focal adhesion complex，F(xiàn)AC)，并與細胞骨架相連，提供細胞遷移的錨著位點?；罨腞AC1能激活PAK1，而PAK1能進一步磷酸化下游的黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，促進新的FAC的形成。細胞胞體的收縮和細胞尾部的退縮是遷移最后的兩個環(huán)節(jié)，這兩個環(huán)節(jié)需要依靠張力纖維收縮和肌動蛋白絲的延長提供動力，RAC1可通過調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，為細胞遷移提供動力。文獻報道，抑制RAC1/PAK1/LIMK1通路的激活可衰減EMT，從而抑制胃癌細胞遷移和侵襲。一項2018年發(fā)表的研究表明，細胞內(nèi)成熟的抗炎因子IL-37直接與RAC1的C端高變區(qū)CAAX基序結(jié)合，進而抑制RAC1膜易位及隨后的下游信號傳導(dǎo)，進一步抑制細胞的遷移。目前，已經(jīng)明確RAC1在腫瘤的侵襲遷移中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，RAC1可能作為評價腫瘤惡性程度與預(yù)測腫瘤侵襲遷移的新型標志物。有理由相信，隨著相關(guān)研究的不斷深入，RAC1在腫瘤侵襲遷移中的作用機制會愈加明確。

圖2 RAC1-GTP激活下游效應(yīng)蛋白PAKs機制示意圖

3 RAC1對惡性腫瘤細胞代謝的調(diào)控及其分子機制

糖酵解信號通路由調(diào)控糖酵解代謝的關(guān)鍵酶組成，主要包括己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM1/2)、丙酮酸脫氫酶和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)等。有氧情況下，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體在NAD存在下催化丙酮酸和CoA轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA和CO。在缺氧條件下，癌細胞或其他高度增殖的細胞，糖酵解產(chǎn)生的大部分的丙酮酸離開線粒體，通過乳酸脫氫酶的作用產(chǎn)生乳酸。一項2019年發(fā)表的研究表明，乳酸脫氫酶B第162位絲氨酸磷酸化會顯著增加其將丙酮酸還原為乳酸的活性，解除了丙酮酸對底物的抑制作用，導(dǎo)致丙酮酸和NADH轉(zhuǎn)化為乳酸和NAD的顯著升高，從而促進腫瘤細胞的糖酵解和腫瘤生長。缺氧條件下，糖酵解產(chǎn)物乳酸可以激活癌細胞中許多信號通路，促進癌細胞的存活、侵襲、遷移、免疫逃逸和血管生成。乳酸脫氫酶的啟動子含有HIF-1α結(jié)合位點，缺氧條件能誘導(dǎo)乳酸脫氫酶的表達，相關(guān)研究表明RAC1是HIF-1激活所必需的。2020年發(fā)表的一項研究結(jié)果表明，激活RAC1可以通過上調(diào)糖酵解，特別是非氧化磷酸戊糖途徑，增加核苷酸代謝，引起乳腺癌細胞的化療耐藥；該研究提示，靶向RAC1是一種克服乳腺癌獲得性化療耐藥的潛在策略。2019年發(fā)表的一項研究表明，在有氧條件下，抑制RAC1活性會通過抑制AKT/FOXO3a的磷酸化，影響糖酵解的關(guān)鍵酶PKM、LDHA和HK1的表達，進一步影響細胞代謝重編程。深入研究腫瘤細胞的代謝重編程相關(guān)分子機制對腫瘤的靶向治療具有重要指導(dǎo)意義。

4 持續(xù)激活型RAC1與永久失活型RAC1

所謂的持續(xù)激活型RAC1，即RAC1蛋白能持續(xù)結(jié)合GTP，可持續(xù)向效應(yīng)器發(fā)出信號產(chǎn)生激活效果，其經(jīng)典的突變形式有RAC1V12，該突變型是RAC1蛋白的第12位氨基酸殘基由甘氨酸G突變?yōu)槔i氨酸V，詳見圖3(自繪模式圖)，該位點突變后，可導(dǎo)致GAPs無法水解與RAC1結(jié)合的GTP，使RAC1處于持續(xù)的激活狀態(tài)。所謂的永久失活型RAC1，即RAC1蛋白無法與GTP結(jié)合，阻止RAC1與相應(yīng)效應(yīng)物結(jié)合發(fā)揮作用，阻斷該基因調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。其經(jīng)典的突變形式有RAC1N17，該突變型是RAC1蛋白的第17位氨基酸殘基由蘇氨酸T突變?yōu)樘於０種，詳見圖3，該位點突變后，可阻止RAC1與GTP結(jié)合，抑制RAC1蛋白向下游效應(yīng)器發(fā)出信號產(chǎn)生失活的效果，RAC1V12和RAC1N17是對比研究RAC1蛋白功能最常用的工具。RAC1在多種腫瘤中廣泛存在著突變，激活型RAC1是驅(qū)動腫瘤惡性演進的重要因素。一項新近的研究闡述了RAC1在多種惡性腫瘤中存在的不同形式突變，在頭頸癌中發(fā)現(xiàn)RAC1C18Y/C18F突變，在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)RAC1C18Y突變，在睪丸癌中發(fā)現(xiàn)RAC1G12V突變，在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)RAC1Q61R突變，在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)RAC1P29S突變，這些常見的突變大多發(fā)生在RAC1蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域上，通過影響RAC1蛋白中P-loop、開關(guān)Ⅰ、開關(guān)Ⅱ的結(jié)構(gòu)，進而影響RAC1蛋白與GTP/GDP的結(jié)合。Zeiz等報道在人體內(nèi)RAC1P29S激活型突變與惡性黑色素瘤的耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)，該文提示，深入研究RAC1突變體調(diào)控細胞的分子機制，將有助于綜合考慮RAC1信號通路的上游與下游諸環(huán)節(jié)，為開展腫瘤的聯(lián)合分子靶向治療研究提供理論依據(jù)。

圖3 RAC1蛋白氨基酸殘基位點G12V和T17N突變示意圖

5 總結(jié)與展望

RAC1作為一個重要的小G蛋白，在腫瘤細胞通訊中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。RAC1通過對PAKs激酶、JNK級聯(lián)信號通路和糖酵解信號通路等通路中重要靶標分子的調(diào)控，影響腫瘤細胞的增殖、遷移和代謝，進一步影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。深入研究RAC1在惡性腫瘤演進中的分子作用機制，可為以RAC1為靶點，開展惡性腫瘤分子靶向抑制劑開發(fā)提供理論依據(jù)；同時也可為以RAC1及其信號通路上下游的效應(yīng)物環(huán)節(jié)為分子靶點，開展惡性腫瘤聯(lián)合分子靶向治療研究提供理論指導(dǎo)。