周殿明，張大龍，張靜，何寧，高崢，張倩，周曉麗，錢智勇

(天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科，天津300011)

玉米已經(jīng)成為僅次于小麥和水稻的第三大谷類作物，是全世界多個(gè)國(guó)家的重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物。但是，許多生物或非生物的影響，如害蟲、自然氣候和雜草等，往往會(huì)對(duì)玉米產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。近年來(lái)，生物技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的發(fā)展為玉米育種在抗除草劑和抗病蟲害方面提供了一條新的解決途徑。

本研究使用的轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)入cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT 5個(gè) 基 因。cp4epsps基因來(lái)自農(nóng)桿菌CP4菌株，能夠編碼產(chǎn)生新的芳香氨基酸生物合成用蛋白，該蛋白對(duì)草甘膦的親合力大大降低，從而能使植物產(chǎn)生草甘膦抗性。Cry1Ab和Cry3Bb均屬于Bt類蛋白，Bt蛋白由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生。Cry1Ab可以抵御歐洲玉米螟，西南玉米螟和亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲。Cry3Bb主要作用于玉米雙斑螢葉甲等鞘翅目類昆蟲。但是，Bt蛋白本身對(duì)人類沒(méi)有任何毒性。ZmHPT來(lái)自玉米本身，可以提高植物體內(nèi)的維生素E總含量。ZmTMT同樣來(lái)自玉米，可以把低活性的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為高活性的α-生育酚。兩個(gè)基因的結(jié)合可以顯著提高玉米的α-生育酚含量，滿足動(dòng)物飼料的需要。本轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品轉(zhuǎn)入5個(gè)基因后，使其具有抗蟲、抗草甘膦以及高維生素E含量的特性，具有重要的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其安全性評(píng)價(jià)也就具有重要意義。

但是，轉(zhuǎn)基因生物的安全問(wèn)題，即是否具有潛在的人體危害已經(jīng)受到全球范圍內(nèi)廣泛關(guān)注，成為社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題。因此轉(zhuǎn)基因生物的食用安全評(píng)價(jià)也成為該領(lǐng)域的重要工作。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性評(píng)價(jià)已開展了大量研究工作，主要包括理化實(shí)驗(yàn)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。雖然大部分轉(zhuǎn)基因玉米經(jīng)過(guò)食用安全性評(píng)估表明其不具有不良反應(yīng)，但是每一個(gè)新的轉(zhuǎn)化事件的安全性仍需要根據(jù)個(gè)案評(píng)估的原則進(jìn)行研究。本研究依據(jù)“實(shí)質(zhì)等同性”原則，按照《NY/T 1102—2006轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)：大鼠90 d喂 養(yǎng) 試 驗(yàn) 標(biāo) 準(zhǔn)》對(duì) 轉(zhuǎn)cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑玉米進(jìn)行了大鼠90 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，了解分析該轉(zhuǎn)基因玉米是否會(huì)對(duì)大鼠產(chǎn)生亞慢性毒性作用，為該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性評(píng)價(jià)提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

轉(zhuǎn)cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑品質(zhì)性狀改良玉米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?親本)玉米樣品2~8℃條件下儲(chǔ)存。

1.2 主要儀器和試劑

Sysmex XT-2000i五分類血球計(jì)數(shù)儀，TOSHIBA TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀，徠卡EG1140H+C包埋機(jī)，徠卡2145切片機(jī)，徠卡HI1201攤片機(jī)，徠卡ASP300脫水機(jī)，Olympus BX53DP72病理圖像分析系統(tǒng)，賽多利斯CP323S電子天平，賽多利斯TE6100-L電子天平。全自動(dòng)血液分析儀專用試劑(天津鼎信醫(yī)療科技有限公司)，血生化檢測(cè)試劑盒(北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件

選取SPF級(jí)Wistar大鼠140只，6周齡，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)在天津市疾病預(yù)防控制中心SPF級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行。環(huán)境溫度20～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，采用人工照明按12 h/12 h明暗交替，換氣次數(shù)15次/h。動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.4 劑量設(shè)計(jì)與飼喂方式

普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，動(dòng)物按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分成7組，每組20只，雌雄各半。基礎(chǔ)飼料對(duì)照組：飼喂基礎(chǔ)維持飼料；對(duì)照玉米低劑量組：飼喂含12.5%非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎呐渲骑暳?；?duì)照玉米中劑量組：飼喂含25%非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎呐渲骑暳?；?duì)照玉米高劑量組：飼喂含50%非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎呐渲骑暳?；轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組：飼喂含12.5%轉(zhuǎn)基因玉米的配制飼料；轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組：飼喂含25%轉(zhuǎn)基因玉米的配制飼料；轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組：飼喂含50%轉(zhuǎn)基因玉米的配制飼料。飼喂時(shí)長(zhǎng)為90 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 動(dòng)物的一般觀察

每日觀察動(dòng)物的活動(dòng)情況、毛色、攝食及排泄情況，中毒癥狀及出現(xiàn)時(shí)間和死亡情況。觀察大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況，記錄每周大鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算每周進(jìn)食量、體質(zhì)量、食物利用率及總進(jìn)食量、總體質(zhì)量增量、總食物利用率。

1.5.2 血常規(guī)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趧?dòng)物禁食16 h后按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血。取EDTA·K抗凝全血測(cè)定紅細(xì)胞壓積、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)及其分類，凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。

1.5.3 血生化檢測(cè)

取全血凝集離心后的血清測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿 素 氮(BUN)、肌 酐(CREA)、總 膽 固 醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、氯(Cl)、鉀(K)、鈉(Na)生化指標(biāo)。

1.5.4 解剖臟器及病理組織學(xué)檢查

解剖動(dòng)物進(jìn)行大體病理學(xué)檢查，取腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸、附睪、子宮、卵巢稱量絕對(duì)質(zhì)量，計(jì)算臟器相對(duì)質(zhì)量(臟/體比值)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦、垂體、心臟、肝、肺、脾、腎、前列腺、腎上腺、胃及十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、甲狀腺、胸腺、睪丸和附睪、卵巢和子宮，各臟器各取一塊組織浸入4%中性甲醛固定液中固定，制作石蠟組織切片，常規(guī)HE染色后，病理組織學(xué)顯微鏡下觀察臟器組織學(xué)病理變化，記錄異常變化。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊，進(jìn)行單因素方差分析(one way ANOVA)；如果方差不齊，進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。各劑量轉(zhuǎn)基因玉米組分別與對(duì)應(yīng)劑量的對(duì)照玉米組進(jìn)行比較，各試驗(yàn)組再與基礎(chǔ)飼料對(duì)照組進(jìn)行比較，以

P

<0.05判定為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 日常觀察

結(jié)果顯示，試驗(yàn)期間各組動(dòng)物活動(dòng)自如，被毛有光澤，鼻、眼、口腔無(wú)異常分泌物，無(wú)中毒死亡情況發(fā)生。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠體質(zhì)量與進(jìn)食量的影響

大鼠體質(zhì)量與進(jìn)食量見表1，雄性動(dòng)物對(duì)照玉米中劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組體質(zhì)量增量高于對(duì)照組，對(duì)照玉米中劑量組總進(jìn)食量高于對(duì)照組，對(duì)照玉米低劑量組、轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組食物利用率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；雌性動(dòng)物體質(zhì)量增量、總進(jìn)食量和總食物利用率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。其余各組進(jìn)食量和體質(zhì)量與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)

表1 大鼠的體質(zhì)量增量、總進(jìn)食量與總食物利用率(n=10，x±s)

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響見表2：雄性動(dòng)物對(duì)照玉米中劑量組腦/體比低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。雌性動(dòng)物轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組子宮/體高于對(duì)照玉米高劑量組，對(duì)照玉米低劑量組脾/體高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。但未見其生物學(xué)意義；其余各組臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。

表2 各組大鼠臟器系數(shù)表(%，n=10，x±s)

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響見表3。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，雄性?dòng)物轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組ALB高于對(duì)照玉米高劑量組；對(duì)照玉米中劑量組GGT和BUN高于對(duì)照組，對(duì)照玉米高劑量組CRE和CHO低于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組CRE低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；但未見生物學(xué)意義。雌性動(dòng)物對(duì)照玉米低劑量組AST低于對(duì)照組，對(duì)照玉米中劑量組ALP高于對(duì)照組，對(duì)照玉米高劑量組CHO低于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組CHO低于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組ALP低于對(duì)照玉米中劑量組，BUN高于對(duì)照組，CHO低于對(duì)照組，CRE低于對(duì)照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組BUN高于對(duì)照玉米高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；雄性動(dòng)物中，對(duì)照玉米中劑量組、對(duì)照玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組Na低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組Na高于對(duì)照玉米中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組K高于對(duì)照玉米低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；對(duì)照玉米中劑量組和對(duì)照玉米高劑量組Cl低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組Cl高于對(duì)照玉米高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；雌性動(dòng)物中，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組Na高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；對(duì)照玉米高劑量組K高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組Cl高于對(duì)照玉米低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；但未見生物學(xué)意義。其余各組各項(xiàng)生化指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。

表3 大鼠血液生化指標(biāo)(n=10，x±s)

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響見表4，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，雄性?dòng)物轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組中性粒細(xì)胞百分比高于對(duì)照組和對(duì)照玉米低劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組中性粒細(xì)胞百分比高于對(duì)照組和對(duì)照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組淋巴細(xì)胞百分比低于對(duì)照組和對(duì)照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組單核細(xì)胞百分比高于對(duì)照玉米中劑量組，對(duì)照玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組紅細(xì)胞壓積百分比低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；雌性動(dòng)物對(duì)照玉米低劑量組血小板計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞百分比均低于對(duì)照組，對(duì)照玉米高劑量組血小板計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，嗜酸細(xì)胞百分比高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組單核細(xì)胞百分比高于對(duì)照玉米低劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組單核細(xì)胞百分比高于對(duì)照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組嗜酸細(xì)胞百分比低于對(duì)照玉米高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；但未見生物學(xué)意義。雄性動(dòng)物轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組凝血酶原時(shí)間低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。上述指標(biāo)均在本檢測(cè)單位正常值范圍內(nèi)，無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系，無(wú)生物學(xué)意義。其余各組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。

表4 大鼠血常規(guī)指標(biāo)(n=10，x±s)

2.6 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束后，解剖大體觀察各組主要臟器未見明顯病變。通過(guò)鏡下觀察，轉(zhuǎn)基因高劑量組、親本高劑量組與對(duì)照組比較，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因樣品引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物典型病理組織學(xué)改變和特異性損傷改變。

3 討論

將轉(zhuǎn)

cry1Ab

、

cry3Bb

、

cp4epsps

、

ZmHPT

和

ZmTMT

基因抗蟲耐除草劑品質(zhì)性狀改良玉米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩追謩e摻入飼料(比例分別為50%、25%、12.5%)喂飼大鼠90 d，試驗(yàn)期間各組動(dòng)物活動(dòng)自如，被毛有光澤，鼻、眼、口腔無(wú)異常分泌物，無(wú)中毒死亡情況發(fā)生。試驗(yàn)期間，部分對(duì)照玉米組和轉(zhuǎn)基因玉米組動(dòng)物體質(zhì)量、進(jìn)食量與常規(guī)基礎(chǔ)飼料對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，部分轉(zhuǎn)基因玉米組動(dòng)物體質(zhì)量、進(jìn)食量與對(duì)照玉米組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，但均未見其生物學(xué)意義；其余各組動(dòng)物體質(zhì)量增量、總進(jìn)食量和總食物利用率與相應(yīng)對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。個(gè)別轉(zhuǎn)基因玉米組和對(duì)照玉米組動(dòng)物臟體比與常規(guī)基礎(chǔ)飼料對(duì)照組比較有顯著性差異(

P

<0.05)，個(gè)別轉(zhuǎn)基因玉米組動(dòng)物臟體比與對(duì)照玉米組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，但無(wú)生物學(xué)意義；其余各組動(dòng)物臟體比值與相應(yīng)對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。

實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)照玉米組和轉(zhuǎn)基因玉米組部分血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)與常規(guī)基礎(chǔ)飼料組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因玉米組部分血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)與對(duì)照玉米組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但均在本檢測(cè)單位正常值范圍內(nèi)，無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系，無(wú)生物學(xué)意義。動(dòng)物解剖時(shí)，大體觀察未發(fā)現(xiàn)異常。病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因樣品引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有典型病理組織學(xué)改變和特異性損傷改變。

綜上所述，采用轉(zhuǎn)cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑品質(zhì)性狀改良玉米進(jìn)行大鼠90 d毒性實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯的生物學(xué)意義。本研究還將結(jié)合理化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白的急性毒性實(shí)驗(yàn)等研究，綜合評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性，為進(jìn)一步的安全性評(píng)價(jià)提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。