蔡綺，高德煜，史建峰，于浩，韓妍，楊柳，趙蕾，王召旭，

(1.云南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，云南昆明650106；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050；3.煙臺(tái)大學(xué)，山東煙臺(tái)264005)

樹(shù)鼩作為一種新型靈長(zhǎng)類試驗(yàn)動(dòng)物，正逐步引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們的關(guān)注。樹(shù)鼩是一種類似松鼠的小型哺乳動(dòng)物，屬于攀鼩目樹(shù)鼩科，廣泛分布于東南亞的熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布在貴州、云南等省份。攀鼩目共2科5屬，分為晝行性樹(shù)鼩科和夜行性筆尾樹(shù)鼩科。我國(guó)的唯一代表樹(shù)鼩種類是樹(shù)鼩屬中的北樹(shù)鼩，又叫中緬樹(shù)鼩，而北樹(shù)鼩中的滇西亞種是目前全世界研究最廣泛的一種樹(shù)鼩類型。相比于嚙齒類，樹(shù)鼩在進(jìn)化分類、基因組解析上更接近靈長(zhǎng)類，而相比于與人類更相似的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物，具有體型小、易飼養(yǎng)、成本低、繁殖時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，樹(shù)鼩具有與人相似的代謝過(guò)程，在代謝性疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤等疾病中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，在模擬人類疾病模型方面較嚙齒類與人類親緣性更揚(yáng)近，樹(shù)鼩內(nèi)分泌器官的總體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與靈長(zhǎng)類更近似。樹(shù)鼩的全基因組測(cè)序表明樹(shù)鼩有93.4%與靈長(zhǎng)動(dòng)物相似，并且通過(guò)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、估算分歧時(shí)間，均支持樹(shù)鼩與靈長(zhǎng)類的親緣關(guān)系更近。樹(shù)鼩的晝夜節(jié)律與人類更接近及對(duì)壓力的敏感性均提示樹(shù)鼩能更好的模擬人類的心理疾??；并且視覺(jué)系統(tǒng)與人類更近似，是進(jìn)行視覺(jué)系統(tǒng)疾病研究的理想模型。近年來(lái)樹(shù)鼩的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)在不斷地豐富，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中許多人類病毒感染的樹(shù)鼩模型成功建立，均顯示樹(shù)鼩未來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。最近轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功應(yīng)用，為樹(shù)鼩模型的未來(lái)發(fā)展提供了廣闊的空間。

遺傳物質(zhì)改變引起DNA損傷的固定，被認(rèn)為具有可遺傳性，并且是惡性腫瘤發(fā)展的環(huán)節(jié)之一。遺傳毒性試驗(yàn)主要是通過(guò)一系列體內(nèi)體外試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)樣品是否會(huì)引起基因突變、染色體結(jié)構(gòu)畸變等遺傳物質(zhì)變化的試驗(yàn)。根據(jù)檢測(cè)的遺傳學(xué)終點(diǎn)將遺傳毒性試驗(yàn)分為檢測(cè)基因突變、染色體畸變、染色體組畸變、DNA原始損傷4種類型。檢測(cè)染色體畸變的體內(nèi)微核試驗(yàn)(OECD474)中微核的形成是細(xì)胞受遺傳毒物影響的遺傳學(xué)終點(diǎn)。微核試驗(yàn)是一種可以快速檢測(cè)導(dǎo)致染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的遺傳毒物的檢測(cè)方法，根據(jù)骨髓細(xì)胞中染色體斷裂形成微核的數(shù)量來(lái)鑒定某物質(zhì)遺傳毒性大小。

目前，國(guó)內(nèi)外樹(shù)鼩的研究主要集中于疾病模型的建立，在醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)領(lǐng)域中樹(shù)鼩還未得到應(yīng)用。因?yàn)闃?shù)鼩與人類親緣性較近，兼具體積小、繁殖時(shí)間短、易于實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用前景廣闊。本研究以樹(shù)鼩為動(dòng)物模型，建立微核試驗(yàn)體系，將樹(shù)鼩作為新型模式動(dòng)物應(yīng)用于醫(yī)療器械生物相容性評(píng)價(jià)進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物選擇

樹(shù)鼩來(lái)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，選擇健康、未產(chǎn)、未孕、未進(jìn)行過(guò)試驗(yàn)的樹(shù)鼩30只，雌雄各半，體質(zhì)量120~150 g，試驗(yàn)前7 d適應(yīng)環(huán)境。小鼠30只來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院試驗(yàn)動(dòng)物資源研究所(SPF級(jí))，雌雄各半，體質(zhì)量18~20 g，6~8周齡，試驗(yàn)前3 d適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 樣品和試劑

樣品為膠原蛋白植入劑，由山西錦波生物醫(yī)藥股份公司生產(chǎn)，批號(hào)20180101，型號(hào)III型。陽(yáng)性對(duì)照品為環(huán)磷酰胺，購(gòu)自阿拉丁。陰性對(duì)照品為氯化鈉，購(gòu)自昆明南疆制藥有限公司。胎牛血清，購(gòu)自天航生物科技有限公司；氯胺酮，購(gòu)自江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微核試驗(yàn)

將樹(shù)鼩和小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為3個(gè)組，分別是陰性對(duì)照組、樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。樹(shù)鼩適應(yīng)環(huán)境7 d后，當(dāng)天稱量體質(zhì)量，計(jì)算給藥量進(jìn)行腹腔注射給藥。陰性對(duì)照組給予生理鹽水，樣品組給予膠原蛋白Ⅲ原液，劑量為10 mL/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺，劑量為40 mg/kg。選擇30 h兩次給藥法，第1次給藥24 h后進(jìn)行第2次給藥，給藥6 h后腹腔注射氯胺酮麻醉，腹腔主靜脈取血并放血處死樹(shù)鼩后立即解剖。股骨用75%乙醇浸泡過(guò)的紗布剔除殘余肌肉，剪斷肌骨。在載玻片上滴加10~20 μL胎牛血清，用止血鉗擠壓股骨使骨髓與血清混合，制備骨髓涂片，對(duì)樹(shù)鼩骨髓紅細(xì)胞微核進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。自然晾干后，用甲醇固定10 min，然后進(jìn)行Gimesa染色，每只樹(shù)鼩在油鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocytes，PCE)中的微核細(xì)胞數(shù)(micronuclei，MN)，并計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞中PCE與正染紅細(xì)胞(normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，使用Leica CTR6500顯微鏡配合圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片采集。

小鼠陰性對(duì)照、樣品注射劑量為50 mL/kg，每只小鼠注射1 mL。陽(yáng)性對(duì)照組劑量為40 mg/kg。第1次給藥24 h后進(jìn)行第2次給藥，第2次給藥6 h后測(cè)量體質(zhì)量，取血后脫頸椎致死。取股骨制備骨髓涂片，對(duì)小鼠骨髓紅細(xì)胞微核進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，步驟同樹(shù)鼩。

1.2.2 組織病理學(xué)檢測(cè)

樹(shù)鼩注射氯胺酮麻醉后，腹腔主靜脈取血并放血，處死后立即解剖，剝離組織取肝、脾、腎，測(cè)量臟器濕質(zhì)量并立即放入10%中性甲醛固定液中固定。1周后將臟器取出做石蠟切片及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色并通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡觀察各器官組織的病理學(xué)特征，記錄病變程度。所采血液進(jìn)行血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)檢測(cè)。小鼠在第2次給藥6 h后測(cè)量體質(zhì)量，取血后脫頸椎致死。取肝、脾、腎，固定、切片及染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組的微核率、PCE/NCE比值和臟器系數(shù)，分別與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較，采用雙側(cè)

t

檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠和樹(shù)鼩微核試驗(yàn)結(jié)果

在小鼠微核試驗(yàn)參考體系中，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞的微核率顯著高于陰性對(duì)照組，樣品組微核率與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(OECD474 Mammalian Erythocyte Micronucleus Test)要求，該試驗(yàn)系統(tǒng)成立。供試樣品組小鼠微核率與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在樹(shù)鼩的微核試驗(yàn)體系中，參考小鼠模型，試驗(yàn)系統(tǒng)成立(表2)，供試樣品組微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，得到與小鼠微核試驗(yàn)一致的結(jié)果。

表1 小鼠微核試驗(yàn)結(jié)果

表2 樹(shù)鼩微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠微核試驗(yàn)中，供試樣品組PCE/NCE的比值未低于陰性對(duì)照組的20%；陰性對(duì)照組、供試樣品組的微核率<5‰，供試樣品組與陰性對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；而陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組間的差異顯著(

P

<0.01)。雌性小鼠和雄性小鼠微核試驗(yàn)PCE/NCE比值和微核率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 微核試驗(yàn)骨髓細(xì)胞涂片

參考小鼠微核試驗(yàn)體系，樹(shù)鼩的微核試驗(yàn)中，供試樣品組PCE/NCE的比值未低于陰性對(duì)照組的20%；陰性對(duì)照組、供試樣品組的微核率<5‰，供試樣品組與陰性對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組間的差異極顯著(

P

<0.01)，雌性樹(shù)鼩和雄性樹(shù)鼩微核試驗(yàn)PCE/NCE比值和微核率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 小鼠和樹(shù)鼩血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

該試驗(yàn)通過(guò)血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)檢測(cè)，與組織病理學(xué)、臟器系數(shù)一起分析供試樣品的毒性及試驗(yàn)體系的可行性。由于小鼠血量較少，只進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

小鼠的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，樣品和陽(yáng)性對(duì)照組的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、平均血小板體積等血常規(guī)生理指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；樹(shù)鼩的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組淋巴細(xì)胞數(shù)量和百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；樹(shù)鼩的血生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，樣品組雌性樹(shù)鼩的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；樹(shù)鼩電解質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，樣品組的電解質(zhì)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組鈣離子的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。

2.3 小鼠和樹(shù)鼩臟器系數(shù)

與陰性對(duì)照組比較，小鼠的臟器系數(shù)結(jié)果中，供試樣品結(jié)果為陰性，陽(yáng)性對(duì)照組脾系數(shù)差異極顯著(

P

<0.01)，見(jiàn)表3。樹(shù)鼩的臟器系數(shù)與陰性對(duì)照組相比，樣品組雄性的腎系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組的脾系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 小鼠臟器系數(shù)

表4 樹(shù)鼩臟器系數(shù)

2.4 小鼠和樹(shù)鼩的肝、脾、腎組織病理學(xué)檢測(cè)

觀察小鼠組織病理學(xué)切片(圖2)，發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組相比，樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組的肝、脾、腎均無(wú)顯著病理學(xué)改變，脾淋巴濾泡和腎小球、腎小管均未見(jiàn)異常。觀察樹(shù)鼩組織病理學(xué)切片，結(jié)果顯示陰性對(duì)照組、樣品組與陽(yáng)性對(duì)照組3組臟器均無(wú)顯著病理學(xué)改變，脾和腎內(nèi)部結(jié)構(gòu)也均無(wú)異常。

圖2 小鼠和樹(shù)鼩臟器組織病理學(xué)切片觀察結(jié)果

3 討論

本研究參考小鼠微核試驗(yàn)方法，建立了以樹(shù)鼩為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)模型。在樹(shù)鼩微核試驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組的骨髓紅細(xì)胞微核率顯著高于陰性對(duì)照組，該試驗(yàn)體系成立。樹(shù)鼩微核試驗(yàn)供試品的檢驗(yàn)結(jié)果與小鼠的檢驗(yàn)結(jié)果一致，綜合上述結(jié)果，證明樹(shù)鼩可以作為模式動(dòng)物進(jìn)行微核試驗(yàn)評(píng)價(jià)。

在微核試驗(yàn)中，PCE/NCE的比值是表征供試品細(xì)胞毒性的重要指標(biāo)，在評(píng)價(jià)遺傳毒性前，應(yīng)首先排除細(xì)胞毒性的影響。在本研究中，樹(shù)鼩的PCE/NCE的比值雖然在可接受范圍內(nèi)，但是數(shù)值與小鼠差異明顯，推測(cè)原因可能是由于動(dòng)物種屬差異和發(fā)育階段不同。另外，根據(jù)研究報(bào)道，按體質(zhì)量/體表面積折算等效劑量系數(shù)，20 g小鼠與130 g樹(shù)鼩的等效劑量系數(shù)為0.636，在試驗(yàn)中兩種動(dòng)物采用的環(huán)磷酰胺劑量體積相同，造成樹(shù)鼩相對(duì)給藥量更高，也可能導(dǎo)致PCE/NCE的比值不同，需要更深入的研究和大量的試驗(yàn)樣本數(shù)值積累，為樹(shù)鼩的PCE/NCE可接受范圍提供數(shù)據(jù)參考。在微核試驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺是一種常用的陽(yáng)性劑，在本研究中，兩種動(dòng)物的陽(yáng)性對(duì)照組微核率均顯著升高，樹(shù)鼩不同性別的微核率差異更小。本研究旨在建立新模式動(dòng)物的試驗(yàn)體系，由于兩種動(dòng)物在遺傳背景、微生物控制及飼養(yǎng)條件等方面存在較大差異，我們并未對(duì)兩種動(dòng)物的反應(yīng)敏感性進(jìn)行比較。

環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑對(duì)血液系統(tǒng)、肝、電解質(zhì)代謝等具有毒副作用，樹(shù)鼩部分指標(biāo)變化明顯。由于樹(shù)鼩的藥物注射劑量更多，導(dǎo)致樹(shù)鼩脾的臟器系數(shù)和血液、電解質(zhì)部分指標(biāo)變化比小鼠明顯。環(huán)磷酰胺會(huì)改變脾組織結(jié)構(gòu)，抑制淋巴細(xì)胞增殖；導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)損傷和急性腎損傷。因此我們對(duì)外周免疫器官脾，環(huán)磷酰胺的主要蓄積器官肝和腎進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，但是未發(fā)現(xiàn)有病理意義的結(jié)果。環(huán)磷酰胺對(duì)脾等免疫器官有明顯的抑制作用，并且由于其自身毒性會(huì)導(dǎo)致機(jī)體肝、腎出現(xiàn)水腫，與該試驗(yàn)結(jié)果兩個(gè)動(dòng)物模型的臟器系數(shù)脾下降，而肝和腎升高一致。樹(shù)鼩陰性樣品發(fā)現(xiàn)雄性脾的臟器系數(shù)略高于雌性，雌性肝、腎系數(shù)略高于雄性，與相關(guān)研究結(jié)果一致。結(jié)合樹(shù)鼩的微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雄性比雌性變化大，推測(cè)雄性樹(shù)鼩比雌性更敏感，該猜測(cè)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，我們發(fā)現(xiàn)相比于小鼠的臟器系數(shù)，樹(shù)鼩的臟器系數(shù)與人類更接近。以中國(guó)男性的臟器系數(shù)(脾0.28%、肝2.35%、腎0.48%)為例，陰性對(duì)照組樹(shù)鼩臟器系數(shù)(脾0.14%、肝3.28%、腎0.81%)對(duì)比陰性對(duì)照組小鼠的臟器系數(shù)(脾0.48%、肝5.14%、腎1.02%)更加接近于人類。

本研究將樹(shù)鼩作為動(dòng)物模型，進(jìn)行了醫(yī)療器械生物相容性評(píng)價(jià)的首次探索。在本試驗(yàn)體系下，相較于小鼠，樹(shù)鼩需要單籠單只飼養(yǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)成本更高，樹(shù)鼩在動(dòng)物質(zhì)量控制相關(guān)條件和標(biāo)準(zhǔn)方面與小鼠仍具有很大差距，但是樹(shù)鼩的應(yīng)用潛力已經(jīng)引起越來(lái)越多的關(guān)注，相關(guān)質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)正在研究和制定，樹(shù)鼩在動(dòng)物模型中的缺點(diǎn)在逐步解決。未來(lái)，樹(shù)鼩在試驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛的應(yīng)用。

(感謝中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所靈長(zhǎng)類研究中心和中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所藥物安全評(píng)價(jià)中心各位老師對(duì)本研究工作的協(xié)助)