陸賀港, 任夢(mèng)楠, 黃海東
(天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院, 天津 300392)
由于人們對(duì)部分自然資源的不合理利用,或自然環(huán)境變動(dòng)等種種原因,導(dǎo)致了土壤性質(zhì)與土壤結(jié)構(gòu)改變,土壤中的微生物數(shù)量與土壤酶活性降低,水土保持能力急劇下降[1],并嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的種植[2]。因此,尋求綠色有效的土壤生態(tài)與結(jié)構(gòu)修復(fù)方法,成為治理土壤的關(guān)鍵。大量分布于荒漠地區(qū)的土壤生物結(jié)皮,在土壤生態(tài)修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景,受到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。作為干旱或半干旱地區(qū)常見(jiàn)地表景觀(guān),生物結(jié)皮是由土壤中的細(xì)菌、藻類(lèi)、地衣及苔蘚等生物,其通過(guò)菌絲體、假根以及分泌物與土壤顆粒結(jié)合,共同形成生物土壤層[3]。具有生物結(jié)皮的土壤可以增強(qiáng)土壤的水肥保持效果,使土壤結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,并表現(xiàn)出明顯的抗風(fēng)雨侵蝕能力[4]。目前,在制備生物結(jié)皮的研究中,大多數(shù)研究者關(guān)注于藻類(lèi)、苔蘚以及真菌等一種或幾種形成的生物結(jié)皮,而對(duì)于細(xì)菌介入的藻類(lèi)生物結(jié)皮討論較少[5]。研究[6]表明,藻類(lèi)所構(gòu)成的土壤結(jié)皮,屬于結(jié)皮發(fā)育的早期形態(tài),其形成及維持的制約因素較多,水肥保持的穩(wěn)定性不強(qiáng),土壤生態(tài)環(huán)境恢復(fù)慢。據(jù)報(bào)道,微生物產(chǎn)生的胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)可以加快土壤結(jié)皮形成,提升土壤保水效果[7],而藻類(lèi)產(chǎn)生EPS限制因素多,產(chǎn)生量少,對(duì)土壤凝集效果弱[8]。針對(duì)這一現(xiàn)象,本文將能夠大量產(chǎn)生EPS的細(xì)菌[9-10]引入土壤并與藻類(lèi)形成混合生物結(jié)皮,并通過(guò)研究藻菌混合結(jié)皮的水肥保持效果,及其對(duì)土壤微生物數(shù)量、酶活性和盆栽玉米幼苗的影響,為藻菌混合結(jié)皮的土壤治理策略提供理論依據(jù)。
供試細(xì)菌Sphingomonassp. D3-1與Massiliaarmeniacasp. ZMN-3,供試藻類(lèi)CladophoraaegagrophilaD3-a與NostocsphaeroidesD3-25,于2016年6月12日分離自?xún)?nèi)蒙古翁牛特荒漠化地區(qū)(東經(jīng)119°01′16″,北緯43°01′19″)。供試玉米為先玉335,由自選系PH6 WC為母本,PH4 CV為父本組配而成。
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;高氏1號(hào)培養(yǎng)基,使用時(shí)每300 ml培養(yǎng)基加入3%重鉻酸鉀1 ml;馬丁氏培養(yǎng)基,加入1%孟加拉紅水溶液,使用時(shí)每100 ml培養(yǎng)基加入1%鏈霉素0.3 ml;BG11培養(yǎng)基[11],恒溫20 ℃,光照強(qiáng)度4 000~6 000 lx(日光燈),光照周期16 h∶8 h;EPS合成菌篩選培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5.0 g,蛋白胨5.0 g,酸水解酵素5.0 g,葡萄糖5.0 g,可溶性淀粉5.0 g,丙酮酸鈉3.0 g,磷酸氫二鉀3.0 g,硫酸鎂0.5 g,瓊脂粉15.0 g,pH值7.0~7.5,30 ℃恒溫;供試發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖40 g,磷酸氫二鉀1.8 g,硫酸鎂0.4 g,硫酸亞鐵0.008 g,硫酸銨2.6 g,酵母粉1.5 g,pH值7.0~7.5。
供試土壤于2017年8月采自天津市武清區(qū)王慶坨(東經(jīng)116°91′07″,北緯39°19′27″),砂質(zhì)潮土,自然風(fēng)干,全氮0.59 g/kg,有效磷5.28 mg/kg,速效鉀37.25 mg/kg,有機(jī)質(zhì)10.73 g/kg,pH值8.13。
1.4.1 微生物制劑的制備及結(jié)皮形成 試驗(yàn)開(kāi)展于2017年9月,采用室內(nèi)盆栽模擬的方法。250 ml三角瓶裝100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基,分別接入2種供試菌,置于旋轉(zhuǎn)式搖床180 r/min,30 ℃震蕩培養(yǎng)72 h,取其發(fā)酵液進(jìn)行1∶1混合后稀釋至7.0億 CFU/ml作為菌劑;將2種供試藻分別于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 d,經(jīng)富集、冷凍干燥得到藻粉進(jìn)行1∶1混合,配制濃度為0.75%制劑作為藻劑。將菌劑與藻劑進(jìn)行等比混合,得到藻菌混合劑。將各生物制劑噴灑至土壤表面,形成土壤結(jié)皮。
1.4.2 生物結(jié)皮保水性測(cè)定 將供試土壤130 g置于塑料花盆中(圓形,直徑6 cm,高6.5 cm),分別加入20 ml水(CK)、菌劑、藻劑和藻菌混合劑,分別設(shè)置3次重復(fù),室溫下自然蒸發(fā),定時(shí)稱(chēng)重計(jì)算土壤含水量,并觀(guān)察土壤結(jié)皮的形成。待各處理水分均完全蒸發(fā)后再次分別加入水15 ml,進(jìn)行第二輪保水試驗(yàn)。
1.4.3 生物結(jié)皮保肥性測(cè)定 將供試土壤130 g置于塑料花盆中?;ㄅ璧男螤詈统叽缤K詼y(cè)定試驗(yàn)。底端打4圓孔,孔直徑0.5 cm,距中心1.5 cm,底端鋪紗布兩層。在花盆中分別加入30 ml水(CK)、菌劑、藻劑和藻菌混合劑,各盆中分別施加100 mg硫酸銨、硫酸鉀和磷酸二氫鉀,分別重復(fù)3次,室溫放置,第8 d與第15 d分別加水25 ml淋溶,收集淋出液并使用Bioprofile300 A多參數(shù)生化分析儀測(cè)定淋出液中的氨離子、磷酸根離子及鉀離子含量。
1.4.4 生物結(jié)皮對(duì)土壤微生物數(shù)量影響 使用經(jīng)保水處理30 d后的土壤進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)方法詳見(jiàn)表1。培養(yǎng)后采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各微生物數(shù)量變化,并觀(guān)察水肥保持試驗(yàn)后供試菌株在土壤中的存活情況。
表1 微生物培養(yǎng)方法
1.4.5 生物結(jié)皮對(duì)土壤酶活性影響 土壤樣品為保水試驗(yàn)處理30 d后的土壤。土壤中的脲酶采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定,蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定,過(guò)氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[12]。
1.4.6 生物結(jié)皮對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)影響 供試土壤5 kg中加60 ml水浸潤(rùn),置入塑料栽培盆中(圓形,直徑25 cm,高18 cm;底具2圓孔,孔徑1 cm,距圓心5 cm),在土壤表面放入經(jīng)清水浸種24 h,25 ℃光照催芽后的玉米種子5顆,覆土1 kg,每盆分別加入菌劑、藻劑、藻菌混合劑及水(CK)各40 ml,分別設(shè)置3次重復(fù),放置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中光照與黑暗12 h交替培養(yǎng),于第7,10,13及15 d時(shí)分別加水20,20,30和30 ml,生長(zhǎng)至20 d時(shí)收獲幼苗,測(cè)量與比較各幼苗的地上/下長(zhǎng)(高)度、地上/下重量(鮮/干重),并使用葉綠素測(cè)定儀(SPAD,日本Konica minolta)測(cè)定葉綠素含量。
1.4.7 數(shù)據(jù)整理與分析 使用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理;使用Origin 2018繪圖;利用SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并使用LSD法進(jìn)行多重比較。
將菌劑、藻劑及藻菌混合劑噴灑于土壤表面后,第2天即可觀(guān)察到土壤表面形成結(jié)皮。從圖1可以看出,由于結(jié)皮保水作用,處理組水分蒸發(fā)量明顯減少,在第3 d時(shí)便展現(xiàn)出明顯差異,至第12 d時(shí),細(xì)菌、藻類(lèi)及藻菌混合結(jié)皮中土壤含水量分別比對(duì)照提高161.0%,15.0%和248.5%,第二次保水試驗(yàn)表明生物結(jié)皮與對(duì)照相比有著明顯的持效性,至第12天時(shí),細(xì)菌、藻及藻菌混合結(jié)皮中土壤含水量分別比對(duì)照提高56.6%,34.4%和61.2%(圖1)。保水試驗(yàn)結(jié)果表明,藻菌混合結(jié)皮具有更穩(wěn)定的水分保持效果,并且保水性以菌劑為主導(dǎo),而藻劑結(jié)皮表現(xiàn)出的保水效果相對(duì)較弱。
圖1 不同生物結(jié)皮含水量的變化
由圖2可知,淋溶試驗(yàn)中,在藻菌混合結(jié)皮影響下,土壤中的氮、磷和鉀的淋失量與CK相比分別減少了79.8%,38.8%和63.2%,在第2次淋溶試驗(yàn)中淋失量分別減少了74.0%,89.9%和32.3%。從圖2可以看出,藻菌混合劑結(jié)皮對(duì)土壤肥料淋出降低效果更明顯。在土壤中,大部分植物所需的營(yíng)養(yǎng)元素會(huì)隨著水的流失而減少[13],細(xì)菌產(chǎn)生的EPS對(duì)土壤顆粒有著凝集作用,形成土壤結(jié)構(gòu)可以有效阻止土壤水分的蒸發(fā)或滲透,進(jìn)而增強(qiáng)了土壤的保肥效果[14],而藻類(lèi)生長(zhǎng)與細(xì)菌相比更緩慢,但其形成結(jié)皮也具有較強(qiáng)的保肥效果[15]。
保水保肥試驗(yàn)表明,藻菌混合結(jié)皮可以使土壤的水肥保持效果明顯提高。
注:不同小寫(xiě)字母表示各處理間差異顯著(α=0.05)。下同。
土壤微生物的數(shù)量與組成,可以在一定程度上反映出土壤的優(yōu)劣程度,與土壤中的元素循環(huán)、污染修復(fù)及植物根際免疫力的調(diào)節(jié)直接相關(guān)[16]。由圖3可以看出,與試驗(yàn)前相比,CK條件下僅使芽孢桿菌數(shù)量顯著降低,而其余微生物指標(biāo)變化差異不顯著。與CK相比,藻菌混合劑對(duì)土壤細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌數(shù)量增加效果顯著,其數(shù)量分別增加8.3,1.8和3.1倍。除藻菌混合劑外,其余處理下的土壤芽孢桿菌數(shù)量均顯著降低,與試驗(yàn)前相比,藻菌混合劑處理的芽孢桿菌數(shù)量降低了12.4%,菌劑與藻劑分別降低了32.6%和50%,其致死原因有待研究。劉玉冰等[17]認(rèn)為生物結(jié)皮可明顯提升土壤微生物數(shù)量,也與本文研究結(jié)果相符。保水保肥試驗(yàn)后的土壤樣品經(jīng)培養(yǎng)后,在EPS培養(yǎng)基及BG11培養(yǎng)基中可分離出大量質(zhì)地黏稠菌落,通過(guò)形態(tài)學(xué)及分類(lèi)學(xué)鑒定,確定為4種試驗(yàn)菌株。試驗(yàn)菌株的存活,進(jìn)一步證實(shí)了藻菌混合結(jié)皮保水保肥的持效性。
圖3 不同生物結(jié)皮的土壤微生物數(shù)量變化
土壤中脲酶、蔗糖酶及過(guò)氧化氫酶的活性可以作為土壤生化反應(yīng)強(qiáng)度的理論依據(jù)[18]。由圖4可知,藻菌混合劑形成的結(jié)皮對(duì)蔗糖酶和脲酶活性的提升與其他處理差異顯著,而過(guò)氧化氫酶活性的提升與菌劑和藻劑處理相比無(wú)顯著性差異;藻菌混合劑處理對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶及脲酶活性與對(duì)照相比,分別提高1.5,1.2和4.3倍。Ghiloufi等[19]研究表明,土壤酶活性主要由土壤中的水和有機(jī)物等環(huán)境因素控制,而與微生物數(shù)量的相關(guān)性并不顯著。在藻菌混合結(jié)皮形成后,土壤中的環(huán)境變得更適宜,從而提升了土壤酶活性。楊航宇等[20]也均認(rèn)為土壤生物結(jié)皮會(huì)提高劣化土壤的酶活性。土壤微生物與土壤酶活性試驗(yàn)結(jié)果分析表明,藻菌混合結(jié)皮可以改善土壤的生態(tài)環(huán)境。
注:脲酶和蔗糖酶活性單位為mg/(g·d);過(guò)氧化氫酶活性單位為mg/(g·h)。
從表2可以看出,藻菌混合劑處理在各項(xiàng)指標(biāo)中與CK相比差異顯著。其中,藻菌混合劑處理的地上部的鮮/干重與CK相比分別增加了30.0%和55.6%,根部的鮮/干重分別增加了55.4%和38.5%,地上部長(zhǎng)度增加16.5%;而對(duì)根部長(zhǎng)度影響中,藻結(jié)皮使玉米幼苗根長(zhǎng)度長(zhǎng)度增加了28.3%,藻菌混合結(jié)皮使幼苗根長(zhǎng)度增加了18.0%;另外,藻菌混合劑使植株葉綠素含量增加了15.1%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,除根長(zhǎng)度指標(biāo)外,細(xì)菌在藻菌混合結(jié)皮中起主導(dǎo)作用。藻結(jié)皮對(duì)玉米幼苗根部長(zhǎng)度的增加影響較大,表明藻類(lèi)形成的土壤結(jié)構(gòu)更有利于玉米幼苗根部發(fā)育,饒本強(qiáng)等[15]也認(rèn)為藻類(lèi)結(jié)皮會(huì)改善土壤條件,促進(jìn)植物的生長(zhǎng)繁殖。玉米盆栽試驗(yàn)結(jié)論,為藻菌混合結(jié)皮的進(jìn)一步利用提供了參考。
表2 不同生物結(jié)皮對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)影響
在土壤結(jié)皮的形成及發(fā)育過(guò)程中,藻類(lèi)生物維持與穩(wěn)定了土壤的生態(tài)結(jié)構(gòu),與土壤環(huán)境密切相關(guān)[21]。細(xì)菌作為土壤中的活躍組分,可以增強(qiáng)土壤肥力,優(yōu)化土壤生態(tài)環(huán)境[22]。將藻類(lèi)與細(xì)菌混合為藻菌混合劑,然后將其均勻噴灑至土壤表面形成混合生物結(jié)皮,細(xì)菌產(chǎn)生EPS對(duì)土壤顆粒與微生物進(jìn)行固定,同時(shí),自養(yǎng)型的藻類(lèi)為異養(yǎng)型的細(xì)菌提供生長(zhǎng)條件,細(xì)菌產(chǎn)生的EPS還可作為呼吸底物供土壤微生物利用[8]。在本研究中,將可以大量產(chǎn)生EPS的細(xì)菌加入土壤中,繁殖速度快的細(xì)菌與大量EPS,配合藻類(lèi)生物,提升了土壤凝集效率,促進(jìn)了土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)形成,增強(qiáng)了土壤結(jié)皮早期的穩(wěn)定性,提高了水資源利用率,增強(qiáng)了土壤微生物活動(dòng),提高了土壤酶活性以及土壤生化反應(yīng)強(qiáng)度[23-24]。此外,在藻菌結(jié)皮影響下的土壤栽培玉米幼苗時(shí),發(fā)現(xiàn)藻菌混合結(jié)皮會(huì)加快玉米幼苗的生長(zhǎng)速度,提高植物活力。但是,細(xì)菌可能產(chǎn)生過(guò)多EPS,對(duì)多孔土壤團(tuán)聚體的產(chǎn)生提供了可靠幫助的同時(shí)[25],也可能影響玉米根系的生長(zhǎng)發(fā)育,而使藻菌混合結(jié)皮的根長(zhǎng)度短于藻類(lèi)結(jié)皮,因此細(xì)菌使用量不宜過(guò)大。藻類(lèi)與細(xì)菌的共同作用,彌補(bǔ)了早期結(jié)皮形成及發(fā)育緩慢與水肥保持效果差的劣勢(shì)。試驗(yàn)分析表明,藻菌混合結(jié)皮的形成,為土壤的生態(tài)的修復(fù)與改良提供了有效的幫助。
由于微生物活動(dòng)易受環(huán)境影響,如應(yīng)用于土地過(guò)酸過(guò)堿、地溫過(guò)高或過(guò)低以及土壤水分嚴(yán)重不足的區(qū)域時(shí),藻菌混合劑發(fā)揮的作用會(huì)小于受環(huán)境影響小的化學(xué)類(lèi)保水劑。在利用藻菌混合結(jié)皮時(shí),應(yīng)需考慮環(huán)境因素,展開(kāi)綜合治理。例如,在耕地退化區(qū)域中人類(lèi)活動(dòng)頻繁、雨水充足時(shí)[26],適合藻菌混合結(jié)皮使用;在荒漠化地區(qū),雖降雨不足但仍有可利用的土壤水[27],也可采用藻菌混合結(jié)皮進(jìn)行治理;沙漠地區(qū)嚴(yán)重缺水,空氣濕度低,降雨稀少,土壤環(huán)境不適宜[28],應(yīng)結(jié)合其他治理措施輔助進(jìn)行;水土流失區(qū)往往水分充足,但因土壤沙化、制備覆蓋少而使土壤被水沖刷,引起土壤養(yǎng)分流失和環(huán)境問(wèn)題[29],也適宜利用藻菌混合結(jié)皮進(jìn)行綜合改良。本研究結(jié)果對(duì)藻菌混合結(jié)皮的土壤治理效果提供了理論支撐,但藻菌配比優(yōu)化研究還有待下一步開(kāi)展,對(duì)藻菌的相互關(guān)系是否為共生關(guān)系,還有待進(jìn)一步研究。
本研究中,我們通過(guò)研究藻菌混合結(jié)皮的形成與土壤水肥保持及玉米幼苗生長(zhǎng)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)藻菌混合結(jié)皮使土壤的水肥保持效果明顯提高,并使土壤中的細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌數(shù)量顯著提高,還增強(qiáng)了土壤蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶及脲酶的活性。此外,在玉米盆栽試驗(yàn)中,玉米幼苗的重量、長(zhǎng)度及葉綠素含量也因藻菌混合結(jié)皮的影響顯著增加。結(jié)果表明,藻菌混合結(jié)皮可以改善土壤生態(tài)環(huán)境,增強(qiáng)土壤的水肥保持效果,為以結(jié)皮法治理土壤提供了理論基礎(chǔ)。