陸賀港, 任夢楠, 黃海東

(天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院, 天津 300392)

由于人們對部分自然資源的不合理利用，或自然環(huán)境變動等種種原因，導致了土壤性質(zhì)與土壤結構改變，土壤中的微生物數(shù)量與土壤酶活性降低，水土保持能力急劇下降[1]，并嚴重影響了農(nóng)作物的種植[2]。因此，尋求綠色有效的土壤生態(tài)與結構修復方法，成為治理土壤的關鍵。大量分布于荒漠地區(qū)的土壤生物結皮，在土壤生態(tài)修復方面具有廣闊的應用前景，受到了科學家們的廣泛關注。作為干旱或半干旱地區(qū)常見地表景觀，生物結皮是由土壤中的細菌、藻類、地衣及苔蘚等生物，其通過菌絲體、假根以及分泌物與土壤顆粒結合，共同形成生物土壤層[3]。具有生物結皮的土壤可以增強土壤的水肥保持效果，使土壤結構更加穩(wěn)定，并表現(xiàn)出明顯的抗風雨侵蝕能力[4]。目前，在制備生物結皮的研究中，大多數(shù)研究者關注于藻類、苔蘚以及真菌等一種或幾種形成的生物結皮，而對于細菌介入的藻類生物結皮討論較少[5]。研究[6]表明，藻類所構成的土壤結皮，屬于結皮發(fā)育的早期形態(tài)，其形成及維持的制約因素較多，水肥保持的穩(wěn)定性不強，土壤生態(tài)環(huán)境恢復慢。據(jù)報道，微生物產(chǎn)生的胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)可以加快土壤結皮形成，提升土壤保水效果[7]，而藻類產(chǎn)生EPS限制因素多，產(chǎn)生量少，對土壤凝集效果弱[8]。針對這一現(xiàn)象，本文將能夠大量產(chǎn)生EPS的細菌[9-10]引入土壤并與藻類形成混合生物結皮，并通過研究藻菌混合結皮的水肥保持效果，及其對土壤微生物數(shù)量、酶活性和盆栽玉米幼苗的影響，為藻菌混合結皮的土壤治理策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與玉米種子

供試細菌Sphingomonassp. D3-1與Massiliaarmeniacasp. ZMN-3，供試藻類CladophoraaegagrophilaD3-a與NostocsphaeroidesD3-25，于2016年6月12日分離自內(nèi)蒙古翁牛特荒漠化地區(qū)(東經(jīng)119°01′16″，北緯43°01′19″)。供試玉米為先玉335，由自選系PH6 WC為母本，PH4 CV為父本組配而成。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；高氏1號培養(yǎng)基，使用時每300 ml培養(yǎng)基加入3%重鉻酸鉀1 ml；馬丁氏培養(yǎng)基，加入1%孟加拉紅水溶液，使用時每100 ml培養(yǎng)基加入1%鏈霉素0.3 ml；BG11培養(yǎng)基[11]，恒溫20 ℃，光照強度4 000～6 000 lx(日光燈)，光照周期16 h∶8 h；EPS合成菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5.0 g，蛋白胨5.0 g，酸水解酵素5.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉5.0 g，丙酮酸鈉3.0 g，磷酸氫二鉀3.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂粉15.0 g，pH值7.0～7.5，30 ℃恒溫；供試發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖40 g，磷酸氫二鉀1.8 g，硫酸鎂0.4 g，硫酸亞鐵0.008 g，硫酸銨2.6 g，酵母粉1.5 g，pH值7.0～7.5。

1.3 供試土壤

供試土壤于2017年8月采自天津市武清區(qū)王慶坨(東經(jīng)116°91′07″，北緯39°19′27″)，砂質(zhì)潮土，自然風干，全氮0.59 g/kg，有效磷5.28 mg/kg，速效鉀37.25 mg/kg，有機質(zhì)10.73 g/kg，pH值8.13。

1.4 試驗方法

1.4.1 微生物制劑的制備及結皮形成 試驗開展于2017年9月，采用室內(nèi)盆栽模擬的方法。250 ml三角瓶裝100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基，分別接入2種供試菌，置于旋轉式搖床180 r/min，30 ℃震蕩培養(yǎng)72 h，取其發(fā)酵液進行1∶1混合后稀釋至7.0億 CFU/ml作為菌劑；將2種供試藻分別于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 d，經(jīng)富集、冷凍干燥得到藻粉進行1∶1混合，配制濃度為0.75%制劑作為藻劑。將菌劑與藻劑進行等比混合，得到藻菌混合劑。將各生物制劑噴灑至土壤表面，形成土壤結皮。

1.4.2 生物結皮保水性測定 將供試土壤130 g置于塑料花盆中(圓形，直徑6 cm，高6.5 cm)，分別加入20 ml水(CK)、菌劑、藻劑和藻菌混合劑，分別設置3次重復，室溫下自然蒸發(fā)，定時稱重計算土壤含水量，并觀察土壤結皮的形成。待各處理水分均完全蒸發(fā)后再次分別加入水15 ml，進行第二輪保水試驗。

1.4.3 生物結皮保肥性測定 將供試土壤130 g置于塑料花盆中。花盆的形狀和尺寸同保水性測定試驗。底端打4圓孔，孔直徑0.5 cm，距中心1.5 cm，底端鋪紗布兩層。在花盆中分別加入30 ml水(CK)、菌劑、藻劑和藻菌混合劑，各盆中分別施加100 mg硫酸銨、硫酸鉀和磷酸二氫鉀，分別重復3次，室溫放置，第8 d與第15 d分別加水25 ml淋溶，收集淋出液并使用Bioprofile300 A多參數(shù)生化分析儀測定淋出液中的氨離子、磷酸根離子及鉀離子含量。

1.4.4 生物結皮對土壤微生物數(shù)量影響 使用經(jīng)保水處理30 d后的土壤進行培養(yǎng)，培養(yǎng)方法詳見表1。培養(yǎng)后采用平板計數(shù)法統(tǒng)計各微生物數(shù)量變化，并觀察水肥保持試驗后供試菌株在土壤中的存活情況。

表1 微生物培養(yǎng)方法

1.4.5 生物結皮對土壤酶活性影響 土壤樣品為保水試驗處理30 d后的土壤。土壤中的脲酶采用靛酚藍比色法測定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定[12]。

1.4.6 生物結皮對玉米幼苗生長影響 供試土壤5 kg中加60 ml水浸潤，置入塑料栽培盆中(圓形，直徑25 cm，高18 cm；底具2圓孔，孔徑1 cm，距圓心5 cm)，在土壤表面放入經(jīng)清水浸種24 h，25 ℃光照催芽后的玉米種子5顆，覆土1 kg，每盆分別加入菌劑、藻劑、藻菌混合劑及水(CK)各40 ml，分別設置3次重復，放置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中光照與黑暗12 h交替培養(yǎng)，于第7，10，13及15 d時分別加水20，20，30和30 ml，生長至20 d時收獲幼苗，測量與比較各幼苗的地上/下長(高)度、地上/下重量(鮮/干重)，并使用葉綠素測定儀(SPAD，日本Konica minolta)測定葉綠素含量。

1.4.7 數(shù)據(jù)整理與分析 使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理；使用Origin 2018繪圖；利用SPSS 23進行數(shù)據(jù)分析，并使用LSD法進行多重比較。

2 試驗結果與分析

2.1 生物的形成及保水效果

將菌劑、藻劑及藻菌混合劑噴灑于土壤表面后，第2天即可觀察到土壤表面形成結皮。從圖1可以看出，由于結皮保水作用，處理組水分蒸發(fā)量明顯減少，在第3 d時便展現(xiàn)出明顯差異，至第12 d時，細菌、藻類及藻菌混合結皮中土壤含水量分別比對照提高161.0%，15.0%和248.5%，第二次保水試驗表明生物結皮與對照相比有著明顯的持效性，至第12天時，細菌、藻及藻菌混合結皮中土壤含水量分別比對照提高56.6%，34.4%和61.2%(圖1)。保水試驗結果表明，藻菌混合結皮具有更穩(wěn)定的水分保持效果，并且保水性以菌劑為主導，而藻劑結皮表現(xiàn)出的保水效果相對較弱。

圖1 不同生物結皮含水量的變化

2.2 生物結皮的保肥效果

由圖2可知，淋溶試驗中，在藻菌混合結皮影響下，土壤中的氮、磷和鉀的淋失量與CK相比分別減少了79.8%，38.8%和63.2%，在第2次淋溶試驗中淋失量分別減少了74.0%，89.9%和32.3%。從圖2可以看出，藻菌混合劑結皮對土壤肥料淋出降低效果更明顯。在土壤中，大部分植物所需的營養(yǎng)元素會隨著水的流失而減少[13]，細菌產(chǎn)生的EPS對土壤顆粒有著凝集作用，形成土壤結構可以有效阻止土壤水分的蒸發(fā)或滲透，進而增強了土壤的保肥效果[14]，而藻類生長與細菌相比更緩慢，但其形成結皮也具有較強的保肥效果[15]。

保水保肥試驗表明，藻菌混合結皮可以使土壤的水肥保持效果明顯提高。

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(α=0.05)。下同。

2.3 生物結皮對土壤微生物數(shù)量的影響

土壤微生物的數(shù)量與組成，可以在一定程度上反映出土壤的優(yōu)劣程度，與土壤中的元素循環(huán)、污染修復及植物根際免疫力的調(diào)節(jié)直接相關[16]。由圖3可以看出，與試驗前相比，CK條件下僅使芽孢桿菌數(shù)量顯著降低，而其余微生物指標變化差異不顯著。與CK相比，藻菌混合劑對土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量增加效果顯著，其數(shù)量分別增加8.3，1.8和3.1倍。除藻菌混合劑外，其余處理下的土壤芽孢桿菌數(shù)量均顯著降低，與試驗前相比，藻菌混合劑處理的芽孢桿菌數(shù)量降低了12.4%，菌劑與藻劑分別降低了32.6%和50%，其致死原因有待研究。劉玉冰等[17]認為生物結皮可明顯提升土壤微生物數(shù)量，也與本文研究結果相符。保水保肥試驗后的土壤樣品經(jīng)培養(yǎng)后，在EPS培養(yǎng)基及BG11培養(yǎng)基中可分離出大量質(zhì)地黏稠菌落，通過形態(tài)學及分類學鑒定，確定為4種試驗菌株。試驗菌株的存活，進一步證實了藻菌混合結皮保水保肥的持效性。

圖3 不同生物結皮的土壤微生物數(shù)量變化

2.4 生物結皮對土壤酶活性的影響

土壤中脲酶、蔗糖酶及過氧化氫酶的活性可以作為土壤生化反應強度的理論依據(jù)[18]。由圖4可知，藻菌混合劑形成的結皮對蔗糖酶和脲酶活性的提升與其他處理差異顯著，而過氧化氫酶活性的提升與菌劑和藻劑處理相比無顯著性差異；藻菌混合劑處理對蔗糖酶、過氧化氫酶及脲酶活性與對照相比，分別提高1.5，1.2和4.3倍。Ghiloufi等[19]研究表明，土壤酶活性主要由土壤中的水和有機物等環(huán)境因素控制，而與微生物數(shù)量的相關性并不顯著。在藻菌混合結皮形成后，土壤中的環(huán)境變得更適宜，從而提升了土壤酶活性。楊航宇等[20]也均認為土壤生物結皮會提高劣化土壤的酶活性。土壤微生物與土壤酶活性試驗結果分析表明，藻菌混合結皮可以改善土壤的生態(tài)環(huán)境。

注：脲酶和蔗糖酶活性單位為mg/(g·d)；過氧化氫酶活性單位為mg/(g·h)。

2.5 生物結皮對玉米幼苗生長的影響

從表2可以看出，藻菌混合劑處理在各項指標中與CK相比差異顯著。其中，藻菌混合劑處理的地上部的鮮/干重與CK相比分別增加了30.0%和55.6%，根部的鮮/干重分別增加了55.4%和38.5%，地上部長度增加16.5%；而對根部長度影響中，藻結皮使玉米幼苗根長度長度增加了28.3%，藻菌混合結皮使幼苗根長度增加了18.0%；另外，藻菌混合劑使植株葉綠素含量增加了15.1%。試驗數(shù)據(jù)表明，除根長度指標外，細菌在藻菌混合結皮中起主導作用。藻結皮對玉米幼苗根部長度的增加影響較大，表明藻類形成的土壤結構更有利于玉米幼苗根部發(fā)育，饒本強等[15]也認為藻類結皮會改善土壤條件，促進植物的生長繁殖。玉米盆栽試驗結論，為藻菌混合結皮的進一步利用提供了參考。

表2 不同生物結皮對玉米幼苗生長影響

3 討 論

在土壤結皮的形成及發(fā)育過程中，藻類生物維持與穩(wěn)定了土壤的生態(tài)結構，與土壤環(huán)境密切相關[21]。細菌作為土壤中的活躍組分，可以增強土壤肥力，優(yōu)化土壤生態(tài)環(huán)境[22]。將藻類與細菌混合為藻菌混合劑，然后將其均勻噴灑至土壤表面形成混合生物結皮，細菌產(chǎn)生EPS對土壤顆粒與微生物進行固定，同時，自養(yǎng)型的藻類為異養(yǎng)型的細菌提供生長條件，細菌產(chǎn)生的EPS還可作為呼吸底物供土壤微生物利用[8]。在本研究中，將可以大量產(chǎn)生EPS的細菌加入土壤中，繁殖速度快的細菌與大量EPS，配合藻類生物，提升了土壤凝集效率，促進了土壤團粒結構形成，增強了土壤結皮早期的穩(wěn)定性，提高了水資源利用率，增強了土壤微生物活動，提高了土壤酶活性以及土壤生化反應強度[23-24]。此外，在藻菌結皮影響下的土壤栽培玉米幼苗時，發(fā)現(xiàn)藻菌混合結皮會加快玉米幼苗的生長速度，提高植物活力。但是，細菌可能產(chǎn)生過多EPS，對多孔土壤團聚體的產(chǎn)生提供了可靠幫助的同時[25]，也可能影響玉米根系的生長發(fā)育，而使藻菌混合結皮的根長度短于藻類結皮，因此細菌使用量不宜過大。藻類與細菌的共同作用，彌補了早期結皮形成及發(fā)育緩慢與水肥保持效果差的劣勢。試驗分析表明，藻菌混合結皮的形成，為土壤的生態(tài)的修復與改良提供了有效的幫助。

由于微生物活動易受環(huán)境影響，如應用于土地過酸過堿、地溫過高或過低以及土壤水分嚴重不足的區(qū)域時，藻菌混合劑發(fā)揮的作用會小于受環(huán)境影響小的化學類保水劑。在利用藻菌混合結皮時，應需考慮環(huán)境因素，展開綜合治理。例如，在耕地退化區(qū)域中人類活動頻繁、雨水充足時[26]，適合藻菌混合結皮使用；在荒漠化地區(qū)，雖降雨不足但仍有可利用的土壤水[27]，也可采用藻菌混合結皮進行治理；沙漠地區(qū)嚴重缺水，空氣濕度低，降雨稀少，土壤環(huán)境不適宜[28]，應結合其他治理措施輔助進行；水土流失區(qū)往往水分充足，但因土壤沙化、制備覆蓋少而使土壤被水沖刷，引起土壤養(yǎng)分流失和環(huán)境問題[29]，也適宜利用藻菌混合結皮進行綜合改良。本研究結果對藻菌混合結皮的土壤治理效果提供了理論支撐，但藻菌配比優(yōu)化研究還有待下一步開展，對藻菌的相互關系是否為共生關系，還有待進一步研究。

4 結 論

本研究中，我們通過研究藻菌混合結皮的形成與土壤水肥保持及玉米幼苗生長的關系，發(fā)現(xiàn)藻菌混合結皮使土壤的水肥保持效果明顯提高，并使土壤中的細菌、真菌和放線菌數(shù)量顯著提高，還增強了土壤蔗糖酶、過氧化氫酶及脲酶的活性。此外，在玉米盆栽試驗中，玉米幼苗的重量、長度及葉綠素含量也因藻菌混合結皮的影響顯著增加。結果表明，藻菌混合結皮可以改善土壤生態(tài)環(huán)境，增強土壤的水肥保持效果，為以結皮法治理土壤提供了理論基礎。