王大鵬，孔麗娜，黃 姍，閆金國(guó)

（濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，山東 青州 262500）

近年來的研究成果深化了我們對(duì)于木葡聚糖生物合成、重排及降解的酶學(xué)認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH）為多基因家族編碼的一類蛋白質(zhì)，屬于糖苷水解酶家族GH16。其對(duì)植物根莖葉的形態(tài)建成、木質(zhì)部的形成中發(fā)揮重要作用，并能影響植株果實(shí)發(fā)育，增強(qiáng)植株抗逆性。

人工改造過的Cas9/gRNA 系統(tǒng)通過gRNA 引導(dǎo)Cas9 蛋白識(shí)別并剪切帶有g(shù)RNA 靶點(diǎn)的雙鏈DNA，用于基因敲除和精確編輯DNA 等操作。CRISPR 技術(shù)進(jìn)行基因敲除和編輯操作的第一步，需要獲得剪切活性高的gRNA 靶點(diǎn)。Cas9/gRNA 剪切活性是由gRNA 靶點(diǎn)的識(shí)別序列決定的，每個(gè)gRNA 的剪切活性都會(huì)不同。本研究經(jīng)體外gRNA 活性檢測(cè)，選取高效靶點(diǎn)，成功構(gòu)建擬南芥XTH33 基因敲除質(zhì)粒，并將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，為進(jìn)一步進(jìn)行XTH33 基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

gRNA 靶點(diǎn)效率檢測(cè)試劑和pUbi-atU6-gRNA 質(zhì)粒骨架均由北京唯尚立德生物科技有限公司購買，DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、Loading Buffer、DNAmarker、T4 磷酸化酶（T4PNK）、質(zhì)粒純化試劑盒、PBS 緩沖液、成品LB 培養(yǎng)基粉末、瓊脂糖粉、農(nóng)桿菌GV3101、T4連接酶、引物合成及測(cè)序由博邁德生物科技有限公司完成。

1.2 XTH33 基因的gRNA 設(shè)計(jì)與合成

首先應(yīng)用在線工具（http：//crispr.mit.edu）設(shè)計(jì)出符合實(shí)驗(yàn)要求的gRNA，gRNA 設(shè)計(jì)的主要原則[2]：必須選擇在靠前的外顯子區(qū)域；3’端要20 個(gè)連續(xù)的堿基序列，有NGG 堿基序列但不包括PAM 序列；并用生物信息學(xué)軟件對(duì)擬南芥進(jìn)行全基因組比對(duì)，盡量降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，以防Cas9 無法工作，需避免染色體和核小體三維結(jié)構(gòu)造成的空間位阻效應(yīng)，設(shè)計(jì)完成后合成引物gRNA-G1-FP1、gRNA-G2-FP2、gRNA-G3-FP3、gRNA-RP。

1.3 體外gRNA 靶點(diǎn)活性檢測(cè)

四 條 引 物gRNA-G1-FPg1、gRNA-G2-FPg2、gRNA-G3-FPg3、gRNA-RP，分別使用T7-gRNA-FPg（1-3）和gRNA-RP 引物對(duì)，以標(biāo)準(zhǔn)gRNA 模板為模板做PCR，對(duì)于每個(gè)樣品50μL 體系擴(kuò)增2 管，檢測(cè)正確后使用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行過柱純化操作，最后使用40μ LDEPC H2O 洗脫DNA，測(cè)濃度（至少要≥70ng/μL）作為后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄的DNA 模板。同時(shí)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)gRNA1（g1）和標(biāo)準(zhǔn)gRNA2（g2）的PCR 產(chǎn)物。酶切DNA 的準(zhǔn)備：將gRNA 靶點(diǎn)（包括PAM 序列）通過搭橋PCR 的方式構(gòu)建到PCR 產(chǎn)物中，回收備用。gRNA 的轉(zhuǎn)錄：10×Transcription Buffer 2μL、rNTPT7 2μL、RNA Polymerase Mix 2μL、gRNA PCR 產(chǎn)物（上一步產(chǎn)物）1μg、DEPC H2O up to 20μL，以上混合后，37℃反應(yīng)2H，反應(yīng)結(jié)束后，加入2μL DNase I，37℃反應(yīng)30min，并對(duì)gRNA 進(jìn)行回 收 與 提 取。Cas9/gRNA 體 外 酶 切：spCas9 1μL、10XspCas9 buffer 2μL、gRNA（體外轉(zhuǎn)錄）50ng、酶切的dsDNA 50ng、ddH2O up to 20μL，充分混合后，37℃反應(yīng)30min，加入3μL DNA Loading Buffer 混合后65℃煮5min，跑2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)比與兩個(gè)對(duì)照gRNA 估算活性。

1.4 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

反應(yīng)體系：XTH-G3-Sense 5μL、XTH-G3-Anti 5μL、ddH2O 15μL 混勻后，95℃3min，95℃到25℃緩慢冷卻，并16℃5min。第一步 的 產(chǎn) 物1μL、Cas9/gRNAVector 1μL、Solution 1μL、Solution2 1μL、H2O 6μL 混勻后16℃反應(yīng)2h。取第二步產(chǎn)物5～10μL 加入到剛解凍的50μLDH5a 感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min 后，42℃熱激90s，冰上靜置2min，然后加入500μL 無抗LB，置于37℃恒溫?fù)u床中，170 轉(zhuǎn)，復(fù)蘇1h 后涂卡納抗性的平板，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落搖菌，并提取質(zhì)粒，直接進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒與農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)一管，混合后冰浴10min。然后置于液氮中8min，隨后37℃水浴5min。從水浴鍋中取出后冰浴2～3min，加入800μl 無抗生素的YEB 液體培養(yǎng)基，28℃180rpm 搖床上培養(yǎng)4h 左右，取出500μl 菌液，均勻地涂布于加50mg/L Kan和50mg/L Rif 的YEB 瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)出單菌落，并進(jìn)行PCR 鑒定。

2 結(jié)果

2.1 體外gRNA 靶點(diǎn)活性檢測(cè)

體外gRNA 靶點(diǎn)活性檢測(cè)結(jié)果見圖1，凝膠電泳結(jié)果顯示G3 靶點(diǎn)活性明顯大于標(biāo)準(zhǔn)品一的酶切效率，在50%以上，表明G3 靶點(diǎn)活性良好，可以使用。

圖1 體外gRNA 活性檢測(cè)結(jié)果

2.2 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

挑取2 個(gè)白色菌落搖菌，提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序比對(duì)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示靶點(diǎn)序列全部插入正確，XTH33 敲除質(zhì)粒pUbi-atU6-gRNA-XTH33 構(gòu)建成功。

圖2 質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)結(jié)果

2.3 pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌

質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 后，28℃培養(yǎng)24h，出單菌落，挑取6 個(gè)單菌落，用引物XTH-G3-Sense：TTGGTCGAGAGTGAGCTTAGCGAGGG，pUbi-atU6-RP：GATGAAGTGGACGGAAG GAAGGAG 進(jìn)行PCR 鑒定。結(jié)果顯示1、2 號(hào)菌落批出430bp 的目的條帶，鑒定正確。成功將pUbi-atU6-gRNA-XTH33 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，鑒定結(jié)果見圖3。

圖3 農(nóng)桿菌菌液PCR 鑒定結(jié)果

3 討論

CRISPR 系統(tǒng)是由Cas 基因和成簇間隔的短回文重復(fù)序列組成。其原理是gRNA 序列可以靶向識(shí)別可以堿基互補(bǔ)的DNA 序列，并在Cas9 蛋白作用下特異性地切割其靶序列[2]。與傳統(tǒng)的siRNA 和shRNA 基因沉默技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 技術(shù)直接在基因水平進(jìn)行操作，改變基因組成，使基因沉默效果更加徹底，而且CRISPR/Cas9 敲除質(zhì)粒構(gòu)建更為簡(jiǎn)單和高效，對(duì)于同物種不同基因，只需要設(shè)計(jì)不同基因的gRNA 序列，并插入載體骨架即可，但Cas9/gRNA 剪切活性與gRNA 靶點(diǎn)的識(shí)別序列有關(guān)，gRNA 的活性高低直接影響基因剪切效率。因此，靈活高效地選取高活性的gRNA，是進(jìn)行敲除質(zhì)粒構(gòu)建并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基因編輯的關(guān)鍵。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的載體構(gòu)建中，為了方便高效的選取高活性gRNA 序列，提高基因敲除成功率，實(shí)驗(yàn)中首先設(shè)計(jì)3 條靶向擬南芥XTH33 基因的gRNA，通過體外檢測(cè)手段檢測(cè)3 條gRNA活性，選取活性最高的靶點(diǎn)XTH33-G3，靶點(diǎn)活性在50%以上，用活性最高的G3 靶點(diǎn)構(gòu)建敲除質(zhì)粒pUbi-atU6-gRNA-XTH33。通過體外gRNA 活性活性檢測(cè)，可以初步判定gRNA 的效率，以便得到高效的敲除質(zhì)粒，此方法省時(shí)省力，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，減少了試錯(cuò)機(jī)會(huì)，可以節(jié)省不必要的費(fèi)用，并提高了基因敲除成功率。

本實(shí)驗(yàn)，成功進(jìn)行了體外gRNA 活性檢測(cè)，并構(gòu)建XTH33 基因的CRISPR/Cas9 高效敲除質(zhì)粒，為以后高效選取gRNA 提供了借鑒，并為下一步進(jìn)行XTH33 基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。