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        胎盤絨毛組織中金屬蛋白酶及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系

        2021-10-11 13:27:50柳欒美張?zhí)烊?/span>郭金霞洛陽北方企業(yè)集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院婦產(chǎn)科河南省洛陽市471000
        醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐 2021年19期
        關(guān)鍵詞:孕早期絨毛復(fù)發(fā)性

        柳欒美 張?zhí)烊?郭金霞 洛陽北方企業(yè)集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南省洛陽市 471000

        復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指連續(xù)發(fā)生≥2次的自然流產(chǎn),是育齡女性生育失敗的主要原因,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致不孕不育,對(duì)女性身心健康造成不良影響[1]。相關(guān)研究顯示,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生率占總?cè)焉锱缘?%~5%,占早期流產(chǎn)病例的30%~40%[2]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因目前尚未明確,已有研究報(bào)道的包括生殖器異常、免疫功能異常、遺傳、環(huán)境因素、胎兒染色體異常[3]。研究者發(fā)現(xiàn),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤和胎盤的發(fā)育過程[4];血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能夠促進(jìn)孕早期胎盤絨毛組織中血管的生成[5]。本文探討了MMP-2、MMP-9及VEGF在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織中的表達(dá)特點(diǎn),旨在為闡明MMPs、VEGF與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系提供參考。

        1 對(duì)象與方法

        1.1 觀察對(duì)象 選取2018年3月—2019年10月間本院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者42例為觀察組。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)連續(xù)性流產(chǎn)≥2次;(2)染色體檢查正常,孕周≤12周,臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)家族史的患者;(2)生殖系統(tǒng)異常的患者。年齡23~38歲,平均年齡(29.40±2.72)歲;妊娠天數(shù)57~74d,平均妊娠(63.08±10.35)d。收集同期自愿終止妊娠的孕早期流產(chǎn)者39例為對(duì)照組,年齡20~37歲,平均年齡(28.71±3.05)歲;妊娠天數(shù)56~76d,平均妊娠(63.71±9.95)d。性別、年齡在兩組患者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者自愿參與并簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1 樣本采集與HE染色。兩組孕婦均行負(fù)壓吸引流產(chǎn)術(shù)終止妊娠,術(shù)中收集胎盤絨毛組織標(biāo)本,平均成兩份,將其中一份標(biāo)本放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存用于RT-PCR檢測(cè);另一份標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液中固定后常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察兩組孕婦胎盤絨毛組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

        1.2.2 胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA水平檢測(cè)。Trizol法提取胎盤絨毛組織標(biāo)本總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用于RT-PCR反應(yīng)模板。反應(yīng)體系共20μl:上、下游引物各1μl、cDNA 1μl、Sybr Green熒光染料10μl、雙蒸餾水7μl。引物序列由上海澤葉生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,MMP-2上游引物5’-GTGTGTGTCTACCATCCTCGCA-3’,下游引物5’-GTGTCTG TCTGCGTAATCTTA-3’;MMP-9上游引物5’-CCCTTGTAGGCCAGGTGG-3’,下游引物5’-CCTCCTCACCTCCACCCG-3’;VEGF上游引物5’-GTCGTCTTTCAA GT ACCTAGGT-3’,下游引物5’-ACACTGTTCGGTTCCGCCACT-3’。反應(yīng)條件:95℃ 10min,95℃ 2min,56℃ 40s,共40個(gè)循環(huán),延伸72℃ 2min。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

        1.2.3 胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白水平檢測(cè)。取胎盤絨毛組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶,高溫、高壓修復(fù)抗原。滴加鼠抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體,均為1∶500稀釋,兔抗人VEGF單克隆抗體(1∶300稀釋),4℃過夜,次日滴加二抗:羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG,均為1∶1 000稀釋,室溫反應(yīng)1h,DAB顯色、蘇木素復(fù)染,切片脫水、透明后封片,倒置顯微鏡下觀察并拍照,Image pro plus 6.0進(jìn)行定量分析,使用積分光密度(IOD)表示MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組胎盤絨毛組織形態(tài)結(jié)構(gòu)比較 對(duì)照組胎盤絨毛形態(tài)規(guī)則,滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)外層結(jié)構(gòu)完整、排列整齊,絨毛間質(zhì)無水腫。觀察組胎盤絨毛形態(tài)不規(guī)則,滋養(yǎng)細(xì)胞外層萎縮融合、數(shù)量減少,內(nèi)層異常增多、排列紊亂,絨毛內(nèi)血管發(fā)育不良、間質(zhì)水腫,血細(xì)胞總量減少,存在少量炎性細(xì)胞。見圖1。

        圖1 兩組胎盤絨毛組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(HE,×200)

        2.2 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖2。

        表1 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

        圖2 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白免疫組化染色(SP ×200)

        2.3 觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示,觀察組胎盤絨毛組織中VEGF與MMP-2、MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.695,P=0.000;r=-0.682,P=0.000);MMP-2與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.631,P=0.000)。

        3 討論

        復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是常見的妊娠期并發(fā)癥,孕12周之前發(fā)生為早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn),孕12~28周發(fā)生為晚期復(fù)發(fā)性流產(chǎn),是不孕不育的主要原因之一,嚴(yán)重影響女性身心健康[6]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因繁多,包括遺傳因素、免疫應(yīng)答異常、胚胎發(fā)育不良等,具體機(jī)制仍未明確。近年研究認(rèn)為,孕期胎盤絨毛組織血管形成障礙、入侵蛻膜細(xì)胞滋養(yǎng)層是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要原因[7]。本文胎盤絨毛組織HE染色結(jié)果提示,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胚胎絨毛血管發(fā)育不良,滋養(yǎng)細(xì)胞分化水平異常導(dǎo)致滋養(yǎng)層厚度變薄,胎盤功能不全可能是復(fù)發(fā)流產(chǎn)的原因。

        金屬蛋白酶是一類依賴鋅離子、鈣離子等金屬離子發(fā)揮催化活性的蛋白水解酶,能夠降解胞外基質(zhì)。相關(guān)研究顯示,金屬蛋白酶與血管生成和侵襲性疾病的發(fā)生有關(guān),能介導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥、惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[8]。其中MMP-2、MMP-9是孕早期滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入子宮內(nèi)膜的主要活性酶。孕早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9,降解胞外基質(zhì)中Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白,為滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入子宮內(nèi)膜創(chuàng)造條件,確保妊娠持續(xù)。VEGF是促內(nèi)皮細(xì)胞分裂原,能促進(jìn)血管形成。孕期母體與胚胎的營養(yǎng)交換基礎(chǔ)為胎盤絨毛組織血管新生。研究發(fā)現(xiàn),復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF存在低表達(dá),可能與孕早期自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)[9]。

        本文結(jié)果顯示,觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組??赏茰y(cè)胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)上調(diào)可能誘發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)母體子宮蛻膜基質(zhì)的過度降解,導(dǎo)致胎盤未發(fā)育完全時(shí)即從宮腔中提前脫離,導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn);VEGF表達(dá)下調(diào)會(huì)影響胚胎絨毛血管的正常生理功能,降低母體對(duì)胚胎的營養(yǎng)供應(yīng),與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)存在關(guān)聯(lián)。相關(guān)性分析顯示,觀察組患者VEGF與MMP-2、MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān),MMP-2與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)。提示VEGF與MMP-2、MMP-9可能共同參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與發(fā)展,具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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