李衛(wèi)霞， 劉曉霞， 陳劍華 ，郭旭麗 ，王雪玲 ，霍忠超

(1. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，邯鄲 056038； 2. 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科，邯鄲 056038)

大氣污染物中直徑≤2.5 μm的細顆粒物(diameter≤2.5 μm particular matter, PM2.5)粒徑小、表面積大、吸附能力強，易于吸附重金屬、細菌、病毒等有害物質(zhì)，具有較強的致病性[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，PM2.5與人體各系統(tǒng)如呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-5]。研究表明，PM2.5暴露能導(dǎo)致肺部氧化應(yīng)激性損傷，促進上皮細胞分泌炎性因子，加重炎癥反應(yīng)[6]。此外，PM2.5還可影響免疫系統(tǒng)功能，使機體的抗感染能力降低，但PM2.5對人T細胞轉(zhuǎn)化功能的影響和具體機制尚不明確。研究用植物凝集素(phytohemagglutin，PHA)刺激人外周血T細胞轉(zhuǎn)化，同時加入不同濃度PM2.5共培養(yǎng)，觀察PM2.5染毒對人T細胞轉(zhuǎn)化功能的影響及其可能作用機制。

1 材料與試劑

1.1 外周血樣本的采集采集12例健康男性志愿者外周血(均為河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院青年教師及學(xué)生志愿者)，年齡20～40歲，無急、慢性疾病、免疫相關(guān)疾病史，近期無服藥史。

1.2 試劑與儀器人外周血淋巴細胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，購自Gibco公司；PHA，購自Sigma-Aldrich公司；活性氧類(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；8-OHdG檢測試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；CCK-8檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所；IL-6和TNF-α ELISA檢測試劑盒，購自Abcam公司。石英纖維濾膜，購自頗爾(中國)有限公司；VFC-PM2.5型大流量采樣器，來自Thermo Fisher Scientific公司；F-2700熒光分光光度計，來自日立(中國)有限公司；iMark酶標(biāo)儀，來自Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 PM 2.5的采集及樣本的制備采樣地點位于河北省邯鄲市河北工程大學(xué)能環(huán)實驗樓4層平臺(北緯36°3'，東經(jīng)114°2')，距地面高度約10 m，東、南兩面緊鄰2條城市主要交通干道，西、北側(cè)分別為教學(xué)樓、學(xué)生宿舍及住宅區(qū)，采樣點周圍5 km范圍內(nèi)無大型工業(yè)污染源。采樣時間為冬季早8：00至次日7：30，采樣時長24 h。將載有PM2.5的濾膜浸入雙蒸水，超聲振蕩3次，30 min/次，真空冷凍干燥，-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PM2.5懸液的制備：用PBS將PM2.5顆粒物制備成1 mg/mL儲備液，超聲振蕩20 min，高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 外周血淋巴細胞的分離和培養(yǎng)采集12例健康志愿者空腹靜脈血，3 mL/例，肝素抗凝。用等體積PBS稀釋抗凝血，緩慢加入6 mL淋巴細胞分離液，400×g離心20 min，吸取淋巴細胞層；PBS漂洗2次，400×g離心10 min，棄上清液，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，配制成1×106個/mL單細胞懸液；分別接種細胞懸液于96、48孔板，參考馮欲靜等[7]方法每孔分別加入終濃度為0、30、100、300 μg/mL的PM2.5懸液及10 μg/mL PHA，混勻，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24、48和72 h。

2.3 CCK-8法檢測T細胞增殖抑制率用96孔板培養(yǎng)細胞，于PM2.5作用時間結(jié)束時根據(jù)CCK-8檢測試劑盒說明書，每孔加入CCK-8溶液10 μL，混勻后37 ℃孵育2 h。于酶標(biāo)儀測定光密度[D(450 nm)]值，并按以下公式計算相應(yīng)參數(shù)：

細胞的增殖抑制率=[1-(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)]×100%

細胞轉(zhuǎn)化值=實驗組平均D值-對照組平均D值[8]

對照組及空白組(non-treatment control, NC)均不含PM2.5或細胞成分。

2.4 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6和8-OHdG水平用48孔板培養(yǎng)細胞，加入不同濃度PM2.5染毒72 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)TNF-α、IL-6和8-OHdG檢測試劑盒說明書檢測培養(yǎng)上清液中炎性因子表達和DNA損傷情況。

2.5 熒光分光光度法檢測T細胞內(nèi)ROS水平熒光探針DCFH-DA進入細胞后可被細胞內(nèi)的脂肪酶水解生成DCFH，細胞內(nèi)的ROS能將不帶熒光的DCFH氧化生成帶熒光的DCF，利用熒光分光光度法檢測生成DCF的熒光強度，測得細胞內(nèi)ROS水平。具體為用48孔板培養(yǎng)細胞，PM2.5染毒72 h后，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min；收集細胞，PBS漂洗2次，200×g離心10 min，收集細胞制成1 mL懸液, 密度1×106個/mL；熒光分光光度儀檢測激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處平均熒光強度。

3 結(jié)果

3.1 PM2.5抑制T細胞增殖T細胞受絲裂原刺激后可被活化，進而轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝能力旺盛的淋巴母細胞，并發(fā)生一系列的增殖反應(yīng)，稱為淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，細胞轉(zhuǎn)化值的高低一定程度上可以反映其免疫功能[9]。本研究用PHA刺激24、48和72 h誘導(dǎo)T細胞轉(zhuǎn)化，檢測PM2.5對T細胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，在PM2.5染毒時間相同時，隨著PM2.5劑量的增加，T細胞的增殖抑制率逐漸升高，轉(zhuǎn)化值逐漸降低；100 μg/mL PM2.5對T細胞的增殖抑制率顯著高于30 μg/mL組(均P<0.01)且轉(zhuǎn)化值顯著低于0 μg/mL組(均P<0.05)；300 μg/mL PM2.5對T細胞的增殖抑制率顯著高于100 μg/mL組，且轉(zhuǎn)化值顯著低于100 μg/mL組(均P<0.05)；PM2.5染毒劑量相同時，隨著染毒時間的延長，T細胞的增殖抑制率和轉(zhuǎn)化值均升高，100 μg/mL PM2.5染毒48 h時T細胞的增殖抑制率顯著高于24 h組(P<0.01)；300 μg/mL PM2.5染毒72 h時T細胞的增殖抑制率顯著高于48 h組，轉(zhuǎn)化值顯著高于24 h組(均P<0.05)(圖1、表1)。以上提示，PM2.5能顯著抑制PHA誘導(dǎo)的T細胞增殖和轉(zhuǎn)化，且抑制率的高低與PM2.5染毒劑量和時間有顯著關(guān)聯(lián)。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞增殖的抑制作用

表1 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞轉(zhuǎn)化值的影響

3.2 PM2.5誘導(dǎo)T細胞分泌細胞因子PM2.5染毒24、48、72 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測促炎細胞因子水平。結(jié)果顯示，隨著PM2.5劑量的增加，細胞分泌IL-6、TNF-α的水平逐漸上升；染毒24 h時，300 μg/mL組PM2.5染毒細胞分泌IL-6的水平顯著高于100 μg/mL組(P<0.05)，100、300 μg/mL組PM2.5染毒細胞分泌TNF-α的水平均顯著高于30 μg/mL組(均P<0.05)；染毒48、72 h時，300 μg/mL組PM2.5染毒細胞分泌IL-6的水平顯著高于100 μg/mL組(均P<0.01)， 且100 μg/mL組高于30 μg/mL組(均P<0.05)；而染毒48、72 h條件下，300、100 μg/mL組細胞分泌TNF-α的水平顯著高于30 μg/mL組(均P<0.05)，且300 μg/mL組PM2.5染毒細胞72 h時IL-6的水平顯著高于同等劑量下48 h組，TNF-α的水平顯著高于同等劑量下24 h組(有P<0.05)(圖2)。由此，PM2.5能顯著刺激PHA誘導(dǎo)的T細胞分泌IL-6和TNF-α，且分泌水平與PM2.5染毒時間及劑量的高低有關(guān)。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖2 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞細胞因子分泌的影響

3.3 PM2.5致T細胞DNA損傷產(chǎn)生8-OHdG在PHA刺激外周血T細胞24、48和72 h時，檢測PM2.5對T細胞DNA損傷的影響。結(jié)果顯示，隨著PM2.5劑量的增加，細胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG水平顯著上升(均P<0.05)；PM2.5染毒細胞時間相同時，100 μg/mL組細胞上清液中8-OHdG水平顯著高于30 μg/mL組，300 μg/mL組顯著高于100 μg/mL組(均P<0.05)；染毒48和72 h時，空白組上清液中8-OHdG水平顯著高于100 μg/mL組(均P<0.05)，但與300 μg/mL組相比無顯著差異(均P>0.05)(圖3)。由此，PM2.5能顯著促進PHA誘導(dǎo)下T細胞8-OHdG產(chǎn)生，且8-OHdG水平與PM2.5水平呈顯著劑量依賴性。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞8-OHdG水平的影響

3.4 PM2.5誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生ROS在外周血T細胞受PHA刺激24、48和72 h時，檢測PM2.5染毒T細胞ROS的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，隨著PM2.5劑量的增加，細胞培養(yǎng)上清液中ROS含量顯著上升，其中PM2.5濃度為30 μg/mL時，上清液中ROS水平顯著高于0 μg/mL組(48、72 h，均P<0.05)；PM2.5為100、300 μg/mL時，上清液中ROS水平均顯著高于30 μg/mL組(24、48和72 h，均P<0.05)(圖4)。由此，PM2.5能顯著增加PHA作用下T細胞ROS的產(chǎn)生，且與PM2.5水平呈顯著劑量依賴性。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖4 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞ROS水平的影響

4 討論

PM2.5作為大氣中的重要污染物，具有很強的吸附能力，可攜帶多種有毒有害物質(zhì)透過肺間質(zhì)進入呼吸以及淋巴系統(tǒng)，進而對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[10]。外周血T細胞是參與機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要組成部分，其數(shù)量和功能異常將嚴重影響人體免疫系統(tǒng)的功能。

通過PM2.5暴露誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞生物學(xué)反應(yīng)，包括細胞毒作用、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，可以評估PM2.5對人體健康的影響[11]。馮欲靜等[7]用不同劑量PM2.5染毒人外周血淋巴細胞，結(jié)果顯示PM2.5可顯著誘導(dǎo)其凋亡，且細胞凋亡率與染毒時間及PM2.5劑量有關(guān)。本研究通過于體外PHA刺激人外周血T細胞轉(zhuǎn)化實驗中加入不同劑量PM2.5共孵育，發(fā)現(xiàn)PM2.5能抑制PHA誘導(dǎo)的T細胞增殖，且抑制率的高低與PM2.5劑量以及染毒時間顯著關(guān)聯(lián)。同樣，Olufunmilola等[12]用PM2.5染毒人外周血淋巴細胞20 h后，再加入結(jié)核菌素刺激5 h，結(jié)果顯示PM2.5暴露抑制了人外周血CD3+T細胞表面CD69分子的表達，阻礙了結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的早期T細胞活化，該結(jié)果進一步證明PM2.5能抑制人外周血T細胞轉(zhuǎn)化，影響機體細胞免疫應(yīng)答水平。

研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5的短期暴露可引起多種免疫細胞和組織炎癥反應(yīng)、免疫毒性反應(yīng)，進而引發(fā)不同的肺部疾病[13-14]。Ma等[15]通過體外研究證明經(jīng)PM2.5處理的巨噬細胞可顯著上調(diào)CD4+和CD8+T細胞IFN-γ、IL-10、IL-17和IL-21水平，且經(jīng)PM2.5刺激的CD4+和CD8+T細胞可誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞死亡，表明PM2.5可促進巨噬細胞依賴性T細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，PM2.5染毒48、72 h可顯著促進PHA誘導(dǎo)的T細胞分泌IL-6、TNF-α等炎性因子，且分泌水平與PM2.5有顯著的劑量依賴關(guān)系。Lu等[16-17]通過體內(nèi)、外研究亦發(fā)現(xiàn)PM2.5能誘導(dǎo)PBMC釋放炎性因子，誘導(dǎo)Th2型分化，導(dǎo)致Th2型細胞因子和ILC2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平顯著升高，肺組織出現(xiàn)炎癥細胞浸潤。本結(jié)果進一步證明PM2.5在誘導(dǎo)Th2型炎性因子產(chǎn)生、促進炎癥反應(yīng)方面作用顯著。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5僅在較高濃度時(100、300 μg/mL)對T細胞免疫功能有顯著影響，該作用濃度遠高于嚴重污染條件下空氣中PM2.5含量[空氣質(zhì)量指數(shù)(air quality index， AQI)>300，PM2.5>250 μg/m3][18]，這也是目前研究PM2.5對機體影響時普遍存在的問題，在較低濃度下通過延長染毒時間能否增加PM2.5對T細胞功能的影響仍需進一步研究。

Liu等[19]通過PM2.5染毒豬肺泡巨噬細胞3D4/21，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5可通過激活TLR4/MyD88通路誘導(dǎo)ROS生成和炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α的釋放進而導(dǎo)致細胞死亡。Yang等[20]的研究同樣提示PM2.5通過誘導(dǎo)過量ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體膜完整性受損，從而降低A549細胞的活性。本研究在PM2.5染毒PHA誘導(dǎo)人外周血T細胞轉(zhuǎn)化過程中同樣發(fā)現(xiàn)，PM2.5能促進淋巴細胞釋放ROS，導(dǎo)致DNA損傷并產(chǎn)生過量8-OHdG，進而抑制PHA誘導(dǎo)的T細胞轉(zhuǎn)化。

綜上所述，PM2.5通過促進淋巴細胞釋放ROS導(dǎo)致DNA損傷，從而抑制PHA誘導(dǎo)的T細胞轉(zhuǎn)化，并促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，本結(jié)果為PM2.5誘導(dǎo)T細胞免疫毒性反應(yīng)的產(chǎn)生提供了實驗依據(jù)。但PM2.5成分復(fù)雜，且因季節(jié)和采樣地的不同差異較大，本研究中PM2.5的主要組分及其誘發(fā)T細胞免疫毒性反應(yīng)的分子機制尚不明確，且PM2.5對T細胞亞群及功能的影響仍需進一步研究。