吳大平，吳煥良，鄭文宏，鄭小妹，謝文蕊，徐璐

(1.海南省儋州市人民醫(yī)院 腫瘤科，儋州 571700；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液腫瘤科，海口 570000)

乳腺癌是嚴重危害世界女性身體健康的常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，2018年全球乳腺癌新發(fā)病例約210萬例，死亡約63萬例，其危害在女性惡性腫瘤中居首位[1]。外科手術(shù)、放療、化療、靶向治療等是乳腺癌臨床治療的主要方式[2-3]，采用乳腺X射線、乳腺磁共振、乳腺超聲、生物標(biāo)志物等篩查方式有助于乳腺癌的早期診斷[4-5]。但迄今為止，乳腺癌患者的預(yù)后并不樂觀，仍需探索新的治療策略。IL-6是一種由T細胞或巨噬細胞分泌的多功能細胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等生物過程[6]，現(xiàn)已被證明是乳腺癌進展的關(guān)鍵因素[7]。資料顯示，miR-204在肝癌、口腔鱗狀細胞癌等腫瘤組織中異常表達，其表達水平與癌細胞遷移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)[8-9]。miR-204過表達可抑制人乳腺癌細胞MCF-7的增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。有研究報道，miR-204通過PI3K/Akt途徑抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[11]，但miR-204調(diào)控乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用機制尚未完全明確。本研究采用免疫組化法檢測IL-6在乳腺癌患者病灶組織中的表達水平，并以外源性IL-6干預(yù)MCF-7細胞，觀察其對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為乳腺癌的早期診斷及靶向治療提供新的試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年3月—2018年2月就診于海南省儋州市人民醫(yī)院的42例未接受放射治療的手術(shù)切除乳腺癌患者為研究對象，患者中位年齡53.5(29～74)歲，均為女性，經(jīng)病理學(xué)確診為乳腺癌，取癌組織和相應(yīng)的癌旁組織。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬簽署了知情同意書。

1.2 材料人乳腺癌細胞MCF-7購自ATCC；FBS、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技有限公司；兔抗人IL-6單克隆抗體、山羊抗兔多克隆抗體、兔抗人Notch1多克隆抗體購自Abcam公司；免疫組化試劑盒、3，3＇-二氨基聯(lián)苯胺(3，3＇-diaminobenzidine，DAB)顯色劑購自北京博奧森生物技術(shù)公司；PVDF購自法國阿科瑪公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自北京盈豐大通科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司；MTT試劑購自華美生物工程公司；增強化學(xué)發(fā)光液購自Solarbio公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室購自Corning公司；所有序列及引物送至上海吉瑪公司完成構(gòu)建。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 將組織樣本按照免疫組化試劑盒說明書要求進行處理，用IL-6抗體(1∶100)、辣根過氧化物酶(horseraddish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)反應(yīng)。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后進行封片和鏡檢。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與分組 用DMEM培養(yǎng)液(15%FBS+1%雙抗)在37 ℃、5 % CO2的恒溫條件下培養(yǎng)和傳代MCF-7細胞。取處于對數(shù)生長期的細胞按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書要求操作，將control mimics、miR-204 mimics、control inhibitors、miR-204 inhibitors分別轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，依次標(biāo)記為miR-con組、miR-204組、anti-miR-con組、anti-miR-204組，轉(zhuǎn)染48 h。將正常培養(yǎng)的MCF-7細胞作為對照組；IL-6(50 ng/mL)培養(yǎng)48 h的MCF-7細胞作為IL-6組；在IL-6組細胞中轉(zhuǎn)染control mimics作為IL-6+miR-con組；在IL-6組細胞中轉(zhuǎn)染miR-204 mimics作為IL-6+miR-204組。

1.3.3 MTT法 取需要檢測的細胞，分別培養(yǎng)0、24、48、72和96 h，然后調(diào)整至1×105個/mL，進行MTT試驗。依次加入MTT溶液和結(jié)晶紫振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測光密度[D(490 nm)]值。

1.3.4 Transwell試驗 取需要檢測的細胞，用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，調(diào)整為1×104個/mL。取200 μL 細胞浸潤包被或未包被基質(zhì)膠的小室上層的聚碳酸酯膜，下室中加入含血清的完全培養(yǎng)液，放在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。輕輕擦去上層殘余細胞，再將聚碳酸酯膜取出進行多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色、封片。最后用顯微鏡觀察、計數(shù)，取平均值。

1.3.5 qRT-PCR 收集需要檢測的細胞和研磨充分的組織勻漿，用TRIzol液提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制成cDNA，最后用實時熒光定量試劑盒檢測miR-204、Notch1 mRNA的表達，結(jié)果以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miR-204、Notch1 mRNA的相對表達水平。

1.3.6 Western blotting 收集待檢測細胞，在冰上充分裂解后進行變形處理，取上清液用于蛋白電泳的上樣。電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，用2.5 %脫脂牛奶溶液封閉2 h，再將膜浸入相應(yīng)的一抗(兔抗人Notch1多克隆抗體，1∶2 000)中4 ℃ 孵育過夜，次日浸入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)溶液中37 ℃孵育1 h。最后用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯影、曝光。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因試驗 首先構(gòu)建熒光報告載體：將Notch1 3＇UTR野生型質(zhì)粒載體(含Notch1 3＇UTR片段)或突變型質(zhì)粒載體(含Notch1 3＇UTR突變片段)克隆至熒光載體pBiFC。待MCF-7細胞生長至50%時用脂質(zhì)體法將其分別與control mimics、miR-204 mimics、control inhibitors和miR-204 inhibitors共轉(zhuǎn)染。最后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞中海腎熒光活性和螢火蟲熒光活性。結(jié)果用螢火蟲熒光活性與海腎熒光活性的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 IL-6在乳腺癌組織中的表達采用免疫組化法檢測42例乳腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中IL-6的表達情況。結(jié)果顯示，IL-6在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05，圖1)。

注：A.免疫組化圖(×100)；B.IL-6在乳腺癌組織及癌旁組織中表達水平的統(tǒng)計分析。與乳腺癌組織比較，*P<0.05。圖1 IL-6在乳腺癌組織中的表達

2.2 外源性IL-6對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的影響以50 ng/mL IL-6干預(yù)MCF-7細胞48 h后檢測細胞活力、遷移和侵襲情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-6組細胞在培養(yǎng)48～96 h其活力呈時間依賴性升高(P<0.05，圖2A)，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著增加(P<0.05，圖2B、C)。

注：A.MTT法檢測MCF-7細胞活力；B.Transwell試驗檢測MCF-7細胞遷移情況；C.Transwell試驗檢測MCF-7細胞侵襲情況。與對照組比較，*P<0.05。圖2 外源性IL-6對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 外源性IL-6對MCF-7細胞中miR-204和Notch1mRNA表達的影響與對照組比較，使用50 ng/mL IL-6處理的MCF-7細胞miR-204 mRNA相對表達水平顯著下調(diào)(P<0.05，圖3A)，Notch1 mRNA相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05，圖3B)。

注：A.qRT-PCR檢測miR-204 mRNA相對表達水平；B.qRT-PCR檢測Notch1 mRNA相對表達水平。與對照組比較，*P<0.05 。圖3 外源性IL-6對MCF-7細胞中miR-204、Notch1 mRNA表達的影響

2.4 過表達miR-204對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的影響將miR-204 mimics轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，用MTT法和Transwell試驗檢測細胞增殖、遷移和侵襲情況。結(jié)果顯示，miR-204組細胞增殖、遷移和侵襲能力較miR-con組均顯著降低(P<0.05)。詳見圖4。

注：A.MTT法檢測MCF-7細胞活力；B.Transwell試驗檢測MCF-7細胞遷移情況；C.Transwell試驗檢測MCF-7細胞侵襲情況。與miR-con組比較，*P<0.05。圖4 過表達miR-204對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 miR-204與 Notch1靶向關(guān)系的驗證采用在線預(yù)測網(wǎng)站TargetScan預(yù)測到Notch1 3＇UTR上存在與miR-204互補的核苷酸序列(圖5A)。雙熒光素酶報告基因試驗和Western blotting檢測結(jié)果顯示，將miR-204 mimics與Notch1 3＇UTR-WT共轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，相對熒光素酶活性降低(P<0.05)，而與Notch1 3＇UTR-MUT共轉(zhuǎn)染時相對熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05， 圖5B)。過表達miR-204時，Notch1蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，抑制miR-204表達時，則Notch1蛋白表達上調(diào)(P<0.05，圖5C)。

注：A.miR-204與Notch1 3＇UTR的結(jié)合位點；B.雙熒光素酶報告基因試驗檢測相對熒光素酶活性；C.Western blotting檢測細胞中Notch1蛋白的表達。與對照組比較， *P<0.05；與miR-con組比較， #P<0.05； 與anti-miR-con組比較， △P<0.05。圖5 miR-204與Notch1靶向關(guān)系的驗證

2.6 過表達miR-204對外源性IL-6介導(dǎo)的MCF-7細胞中Notch1蛋白表達及細胞增殖、遷移和侵襲的影響外源性IL-6能明顯促進MCF-7細胞中Notch1蛋白表達(P<0.05)，促進細胞增殖、遷移和侵襲(P<0.05)；而將miR-204 mimics轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞進行預(yù)處理后，外源性IL-6介導(dǎo)的MCF-7細胞中Notch1蛋白表達水平的升高及細胞增殖、遷移和侵襲能力的增強均在一定程度上有所減弱(P<0.05)。詳見圖6。

注：A.各組細胞中Notch1蛋白表達；B.各組細胞增殖檢測；C.各組細胞遷移檢測；D.各組細胞侵襲檢測。*P<0.05。圖6 過表達miR-204對外源性IL-6介導(dǎo)的MCF-7細胞中Notch1表達及細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

IL是目前人類發(fā)現(xiàn)的調(diào)控作用最廣泛、種類最多的一類細胞因子，在人體自身免疫性疾病、器官纖維化、惡性腫瘤等疾病進程中起重要的調(diào)節(jié)作用；隨著研究的深入，已有多種以IL家族成員為靶點的藥物應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病等疾病的臨床治療[12]。IL-6是心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)等的重要調(diào)節(jié)因子，IL-6分泌的失調(diào)會影響包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)展[13-14]。如Hara等[15]通過對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者血清IL-6檢測發(fā)現(xiàn)，患者血清中IL-6水平與總生存率呈負相關(guān)；Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可通過調(diào)節(jié)多種靶基因表達增強肝癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，其在血清中水平越高，患者預(yù)后越差；IL-6可作為肝癌患者的獨立預(yù)后指標(biāo)，并且IL-6在乳腺癌組織中高表達[17]；已有報道稱，IL-6可通過增加乳腺癌細胞中YAP的去磷酸化、核易位和轉(zhuǎn)錄活性來顯著促進雌激素受體陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲[18]。本研究采用免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，IL-6在乳腺癌患者病灶組織中呈高表達，外源性IL-6干預(yù)能明顯促進MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA廣泛分布于生物細胞中，參與細胞增殖、分化、血管生成、胚胎發(fā)育等生物過程，在腫瘤分期、病情分級、遠處轉(zhuǎn)移等進程中起重要的調(diào)節(jié)作用[19]。其中，miR-204在宮頸癌組織和細胞系中顯著下調(diào)，miR-204的過表達可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，導(dǎo)致細胞周期停滯在G0/G1期，并促進細胞凋亡，起到抑癌作用[20]。此外，Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-204可抑制非小細胞肺癌細胞遷移、侵襲及腫瘤轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-204的過表達具有抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，這與前人研究的結(jié)果[10]相一致。

Notch信號通路是由受體、配體、DNA結(jié)合蛋白組成的復(fù)雜信號系統(tǒng)，在多種組織或器官早期發(fā)育中起調(diào)控作用。其中，Notch1是主要的Notch受體，在胃癌、鼻咽癌等多種腫瘤組織中均有表達，通過下調(diào)Notch1信號通路可阻滯細胞周期，抑制癌細胞生長、遷移和侵襲[22-23]。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過Notch1信號通路抑制前列腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移。已有研究表明，在乳腺癌中激活Notch1信號通路可逆轉(zhuǎn)芍藥苷對癌細胞增殖和侵襲的抑制作用；反之，敲減Notch1則其作用增強[25]。本研究使用外源性IL-6干預(yù)MCF-7細胞，發(fā)現(xiàn)細胞中miR-204 mRNA表達下調(diào)而Notch1 mRNA表達上調(diào)；過表達miR-204可負向調(diào)控Notch1蛋白表達，抑制MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲，并減弱IL-6對MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。

綜上所述，IL-6在乳腺癌組織中高表達，外源性IL-6可抑制MCF-7細胞中miR-204表達并激活Notch1信號通路，從而促進細胞增殖、遷移和侵襲。這一研究結(jié)果或許能為乳腺癌的早期診斷及靶向治療提供新思路。