何錫忠，林 鷙，趙本進(jìn)，彭麗英

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

ST 細(xì)胞（豬睪丸細(xì)胞）一般用于病毒增殖和分離，廣泛適用于豬傳染性胃腸炎病毒和豬偽狂犬病病毒（PRV）等病毒的增殖，是豬細(xì)小病毒的理想宿主。許多疫苗生產(chǎn)用宿主細(xì)胞都實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、無血清懸浮培養(yǎng)[1-2]。采用懸浮培養(yǎng)ST 細(xì)胞，可縮短疫苗生產(chǎn)周期，降低企業(yè)生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量[3-4]；無血清細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不僅降低了血清生產(chǎn)成本，大量提高細(xì)胞數(shù)量，也可保證疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。因此，ST 細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)具有很大的發(fā)展前景。由于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)的不同條件可影響細(xì)胞生長代謝和病毒繁殖狀況，本試驗(yàn)通過研究細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、震蕩速度和不同搖瓶規(guī)格與細(xì)胞生長的關(guān)系，考察培養(yǎng)過程中的限制性因素對ST 細(xì)胞生長的影響；同時(shí)研究細(xì)胞接種密度、感染量和培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)胞繁殖病毒的關(guān)系，確定培養(yǎng)過程中的不同因素對ST 細(xì)胞繁殖PRV 的影響，以期為獲得生長良好的高密度ST 細(xì)胞和提高PRV 繁殖能力提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和毒株 懸浮ST 細(xì)胞株，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬繁殖障礙病課題組馴化保存；PRV sx-gE 毒株，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所課題組保存。

1.1.2 試劑及耗材 ST-S 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由上海源培生物科技股份有限公司提供；125 mL、250 mL、1 L Erlenmeyer flask 搖瓶，購自CORNING 公司。

1.1.3 主要儀器 軌道式振蕩器，購自杭州奧盛儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，購自Thermo 公司；Retiga2000R 高敏感度冷熒光數(shù)碼顯微鏡，為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 ST 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

先將振蕩器置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，然后在超凈工作臺內(nèi)將適量ST 懸浮細(xì)胞移植到125 mL Erlenmeyer flask 搖瓶，放置在振蕩器上培養(yǎng)，在其他對應(yīng)參數(shù)固定不變的條件下，對影響ST 細(xì)胞懸浮生長的初始接種密度、培養(yǎng)時(shí)間和搖瓶轉(zhuǎn)速等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化比較，并觀察不同搖瓶規(guī)格對細(xì)胞生長的影響。

1.2.1 接種密度對細(xì)胞生長的影響 設(shè)置細(xì)胞初始接種密度分別為0.25×106、0.50×106、1.00×106、1.50×106cells/mL，在培養(yǎng)溫度37 ℃和搖瓶震蕩速度140 r/min 條件下，培養(yǎng)24、48 h時(shí)各取樣1 mL 計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，觀察接種密度對ST細(xì)胞生長的影響。

1.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對細(xì)胞生長的影響 按照前述確定的最佳細(xì)胞接種密度，在培養(yǎng)溫度37 ℃和搖瓶震蕩速度140 r/min 條件下，每隔24 h 取樣1 mL計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，持續(xù)取樣至72 h，觀察培養(yǎng)時(shí)間對細(xì)胞生長的影響。

1.2.3 震蕩速度對細(xì)胞生長的影響 按照前述確定的最佳細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時(shí)間，在細(xì)胞初始接種密度1.00×106cells/mL，培養(yǎng)溫度37 ℃，震蕩速度分別為100、140 和160 r/min 條件下，各取樣1 mL 計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)做3 瓶取其平均數(shù)，觀察不同震蕩速度對細(xì)胞生長的影響。

1.2.4 不同規(guī)格搖瓶對細(xì)胞生長的影響 按照前述確定的最佳細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、震蕩速度，將適量ST 懸浮細(xì)胞分別移植到250、1 000 mL 規(guī)格搖瓶中，在培養(yǎng)溫度37 ℃條件下，各取樣1 mL計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)做3 瓶取其平均數(shù)，觀察不同規(guī)格搖瓶對細(xì)胞生長的影響。

1.3 ST 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)增殖PRV 在其他對應(yīng)參數(shù)固定不變的條件下，按照優(yōu)化出的ST 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將50 mL ST 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至125 mL Erlenmeyer flask 搖瓶后，放在振蕩器上培養(yǎng)。對影響ST 懸浮細(xì)胞增殖PRV 的接種細(xì)胞初始密度、感染量和培養(yǎng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1 不同細(xì)胞接種密度對病毒增殖的影響 在細(xì)胞初始接種密度分別為1.00×106、2.00×106、3.00×106cells/mL，接毒劑量MOI=1、培養(yǎng)溫度37 ℃和搖瓶震蕩速度140 r/min 條件下，接毒后培養(yǎng)72 h 時(shí)各取樣1 mL 測定TCID50，每組重復(fù)做3 瓶取其平均數(shù)，觀察細(xì)胞接種密度對病毒增殖的影響。

1.3.2 不同感染量對病毒增殖的影響 按照前述確定的最佳細(xì)胞接種密度，在接毒劑量分別為MOI=0.5、1.0 和1.5 時(shí)，接毒后培養(yǎng)72 h 各取樣1 mL測定TCID50，觀察接毒劑量對病毒增殖的影響。

1.3.3 不同收獲時(shí)間對病毒增殖的影響 按照前述確定的最佳細(xì)胞接種密度、病毒感染量，在其他對應(yīng)參數(shù)固定不變條件下接毒。在接毒后培養(yǎng)24、48、60、72 和84 h 時(shí)分別取樣1 mL 測定TCID50，觀察收獲時(shí)間對病毒增殖的影響。

1.4 活細(xì)胞計(jì)數(shù)和TCID50測定 取樣后立即進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含10 g/L 結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。TCID50測定按照常規(guī)方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞接種密度對細(xì)胞生長的影響

由表1 可知，細(xì)胞初始接種密度為1.00×106cells/mL 時(shí)，懸浮培養(yǎng)48 h 后ST 細(xì)胞擴(kuò)增了4.0 倍；初始接種密度分別為0.25×106、0.50×106cells/mL 時(shí)，懸浮培養(yǎng)48 h 后ST 細(xì)胞雖然也能倍比擴(kuò)增但最終細(xì)胞密度過低；初始接種密度為1.50×106cells/mL 時(shí)，懸浮培養(yǎng)48 h 后ST細(xì)胞雖然擴(kuò)增了5.0 倍，但其細(xì)胞活率比細(xì)胞初始接種密度（1.00×106cells/mL）低。因此確定最佳細(xì)胞初始接種密度為1.00×106cells/mL。

表1 細(xì)胞接種密度對ST 細(xì)胞生長的影響

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對ST 細(xì)胞生長的影響

結(jié)果（表2）顯示，在ST 細(xì)胞初始接種密度1.00×106cells/mL、培養(yǎng)48 h 后，最終細(xì)胞密度為4.00×106cells/mL，高于培養(yǎng)24 h 后的1.80×106cells/mL和72 h 后的3.00×106cells/mL。因此確定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對ST 細(xì)胞生長的影響

2.3 震蕩速度對ST 細(xì)胞生長的影響

由表3 可知，在震蕩速度100、140 和160 r/min條件下懸浮培養(yǎng)ST 細(xì)胞，48 h 后細(xì)胞密度分別為1.50×106、4.20×106和4.00×106cells/mL，140和160 r/min 不同轉(zhuǎn)速培養(yǎng)結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）；震蕩速度為100 r/min 時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞密度與初始接種密度相比只增加了0.5 倍。因此選擇最佳震蕩速度為140 r/min.

表3 震蕩速度對ST 細(xì)胞生長的影響

2.4 不同規(guī)格搖瓶對ST 細(xì)胞生長的影響

將適量的ST 懸浮細(xì)胞分別在250、1 000 mL規(guī)格搖瓶中培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示培養(yǎng)后ST 細(xì)胞密度分別為4.30×106、4.10×106cells/mL（表4）。兩種規(guī)格搖瓶培養(yǎng)結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），可見ST 懸浮細(xì)胞適宜在此兩種規(guī)格搖瓶中培養(yǎng)。

表4 不同規(guī)格搖瓶對ST 細(xì)胞生長的影響

2.5 不同細(xì)胞接種密度對病毒增殖的影響

由表5 可見，以2.00×106cells/mL ST 懸浮細(xì)胞接種病毒培養(yǎng)72 h 后毒價(jià)最高（109.00TCID50/mL）；接種密度為3.00×106cells/mL 時(shí)，毒價(jià)處于中間，與前者差異不顯著（P＞0.05）；接種密度為1.00×106cells/mL 時(shí)，毒價(jià)僅為105.25TCID50/mL。因此在使用ST 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)PRV 時(shí)，選擇最佳細(xì)胞接種密度為2.00×106cells/mL。

表5 不同細(xì)胞接種密度對病毒增殖的影響

2.6 不同感染量對病毒增殖的影響

不同感染病毒量對細(xì)胞繁殖病毒有一定影響，如表6 所示，以病毒感染量MOI=1.0 接種ST細(xì)胞，培養(yǎng)72 h 后毒價(jià)為109.25TCID50/mL，其次是MOI=1.5，而感染量MOI=0.5 相比較感染量MOI=1.0 低4 個(gè)滴度。由此可見，適量的病毒感染量有利于病毒在ST 細(xì)胞內(nèi)繁殖，選擇病毒最適感染量為MOI=1.0。

表6 不同感染量對病毒增殖的影響

2.7 不同收獲時(shí)間對病毒增殖的影響

表7 顯示，在細(xì)胞接種初始密度2.00×106cells/mL、病毒感染量MOI=1.0 和其他對應(yīng)參數(shù)固定不變條件下，接種病毒培養(yǎng)48 h時(shí)毒價(jià)顯著升高（107.25TCID50/mL），至60 h 毒價(jià)達(dá)到最高（109.00TCID50/mL），并維持至72 h，繼續(xù)培養(yǎng)至84 h 時(shí)毒價(jià)逐漸下降至108.00TCID50/mL。因此選擇病毒最佳收獲時(shí)間為60～72 h。

表7 不同收獲時(shí)間對病毒增殖的影響

3 討論

以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為病毒增殖的基質(zhì)生產(chǎn)疫苗，具有重復(fù)性高、生產(chǎn)穩(wěn)定、抗原特異性更接近自然株、變態(tài)反應(yīng)少等優(yōu)勢[5]。阿爾祖古麗·阿依丁等[6]利用無血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)豬繁殖和呼吸障礙綜合征（PRRS）疫苗，可在短期內(nèi)大規(guī)模增殖PRRS 病毒，在疫情暴發(fā)時(shí)提供足夠的疫苗產(chǎn)品。懸浮細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，可有效擴(kuò)大細(xì)胞的生長密度，同時(shí)也避免了動(dòng)物源性成分給疫苗生產(chǎn)過程帶來的不確定性風(fēng)險(xiǎn)因素。陳宏等[7]用緩降血清的方法建立了MDCK 細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)，成功懸浮培養(yǎng)出流感病毒，并使病毒保持較高的活力。

本研究中，通過對影響ST 細(xì)胞懸浮生長的細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時(shí)間和搖瓶轉(zhuǎn)速等工藝參數(shù)進(jìn)行比較優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)初始接種密度1.00×106cells/mL、搖瓶轉(zhuǎn)速140 r/min、懸浮培養(yǎng)48 h 細(xì)胞擴(kuò)增了4.0倍，且細(xì)胞活力高，此ST 細(xì)胞培養(yǎng)工藝適用于不同規(guī)格搖瓶。此外，本試驗(yàn)初步確定了優(yōu)化后的ST 懸浮細(xì)胞增殖PRV 工藝：初始細(xì)胞接種密度2.00×106cells/mL、感染量MOI=1.0、培養(yǎng)時(shí)間60～72 h 時(shí)，毒價(jià)可達(dá)到109.00TCID50/mL。

本研究初步表明，高密度接種時(shí)，細(xì)胞更容易進(jìn)入對數(shù)生長期，但高密度接種的細(xì)胞同體積內(nèi)所需營養(yǎng)程度比低密度接種的更強(qiáng)，使得活細(xì)胞比生長速率較快下降。因此，在ST 細(xì)胞培養(yǎng)過程中為能保持較高的細(xì)胞比生長速率，并獲得更高的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，提高培養(yǎng)效率，同時(shí)減少種子細(xì)胞的制備量，以1.00×106cells/mL 左右為宜。

雖然2.00×106cells/mL 以上ST 懸浮細(xì)胞接種病毒后毒價(jià)都較高，但為更快更經(jīng)濟(jì)地獲得較高病毒量，在搖瓶培養(yǎng)PRV 時(shí)，應(yīng)選擇2.00×106cells/mL左右的細(xì)胞密度接種病毒。

不同感染病毒量對細(xì)胞繁殖病毒有一定影響，感染量MOI 過高可能造成單位體積內(nèi)細(xì)胞過多感染病毒引起細(xì)胞過早衰老甚至死亡，導(dǎo)致同體積內(nèi)活病毒含量降低。因此，適量的病毒感染量有利于病毒在ST 細(xì)胞內(nèi)繁殖。