張玉杰，劉紅祥，劉 東，張 翔，杜元釗

（青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266114）

鴨源雞桿菌（Gallibacterium anatis）作為巴氏桿菌科雞桿菌屬的一個(gè)代表種[1]，常引起開產(chǎn)蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫和敗血癥等生殖系統(tǒng)疾病[2]，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降。臨床上，青年雞感染該菌后無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，不易被察覺，直到雞群開產(chǎn)后，由于各種應(yīng)激因素刺激，感染雞群常突然發(fā)病，造成極大經(jīng)濟(jì)損失。

20 世紀(jì)90 年代，我國(guó)北方地區(qū)開產(chǎn)后的蛋種雞或肉種雞在經(jīng)3～5 輪人工授精后，出現(xiàn)嚴(yán)重的產(chǎn)蛋下降或孵化率降低現(xiàn)象，但對(duì)其病因長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)未有明確定論。直到2019 年初，張玉杰等[3]對(duì)我國(guó)人工授精后的蛋種雞或肉種雞產(chǎn)蛋下降問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并證實(shí)該病病原是鴨源雞桿菌。臨床上，該細(xì)菌與新城疫病毒（非典型新城疫）、雞傳染性支氣管炎病毒、禽腦脊髓炎病毒、禽腺病毒EDS-76 等[4]引起的臨床癥狀相似，不易區(qū)分，臨床鑒別診斷較為困難，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

目前，鴨源雞桿菌的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌分離鑒定、ELISA、PCR、乳膠凝集試驗(yàn)等[5-6]，而平板凝集試驗(yàn)鮮有報(bào)道。本研究將已分離鑒定的鴨源雞桿菌YT-1 株制備成平板凝集抗原，初步建立了該菌的平板凝集檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法對(duì)全國(guó)不同地區(qū)雞場(chǎng)采集的雞血清樣品進(jìn)行了鴨源雞桿菌血清抗體檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨源雞桿菌YT-1 株，由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)服務(wù)部檢測(cè)中心，自山東省煙臺(tái)市人工授精后產(chǎn)蛋下降的蛋種雞輸卵管內(nèi)分離鑒定并保存。雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、雞巴氏桿菌、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腺病毒等病原的陽(yáng)性血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞臨床血清樣品436 份，采集自2020 年以來(lái)全國(guó)不同地區(qū)150～200 日齡的開產(chǎn)母雞；健康家兔（體質(zhì)量約2 kg），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；LB 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD 公司；綿羊血平板培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬血清，購(gòu)自HyClone 公司。

1.2 方法

1.2.1 鴨源雞桿菌復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng) 從-80 ℃低溫冰箱中取出凍存管，于37 ℃水浴中解凍，用接種環(huán)將其劃線接種在綿羊血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h；按照文獻(xiàn)[5]的方法，對(duì)復(fù)蘇菌落進(jìn)行鑒定；將鑒定好的菌落接種于綿羊血平板復(fù)壯，連續(xù)傳3代后用于抗原制備；挑取綿羊血平板上的單菌落接種于含5%馬血清的TSB 培養(yǎng)基中，200 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h，按照體積比1:100 接種于100 mL 新鮮TSB 培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)菌滅活及檢驗(yàn) 向菌液中加入0.2%的甲醛，37 ℃ 150 r/min 作用24 h 滅活細(xì)菌；將以上菌液4 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液，用0.5%石炭酸生理鹽水洗滌菌泥3 遍，收集菌泥，再用0.5%石炭酸生理鹽水10 mL 重懸菌泥；取滅活后的菌液100 μL 涂布于綿羊血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h（此時(shí)應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)）。

1.2.3 陽(yáng)性和陰性血清制備 將制備好的鴨源雞桿菌抗原與白油佐劑按照體積比2:3 混合，乳化后皮下多點(diǎn)注射免疫健康家兔，1 mL/次（1010CFU），每隔7 d 免疫1 次，連續(xù)免疫3 次；三免后14 d，無(wú)菌心臟采血，分離血清分裝作為陽(yáng)性血清；采集對(duì)照組健康家兔血清并分裝，作為陰性血清。以上血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法建立 分別取30 μL 的陽(yáng)性血清、陰性血清、抗原液和稀釋液至一張干凈的載玻片上，再用移液器各取30 μL 鴨源雞桿菌抗原液至載玻片上，分別與陽(yáng)性血清、陰性血清、抗原液和稀釋液充分混勻，室溫靜置3 min后觀察。

1.2.5 抗原濃度調(diào)節(jié)及染色 將已知濃度的滅活菌液用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋，調(diào)整其濃度為9×109、7×109、5×109、3×109和1×109CFU/mL 5 個(gè)梯度，然后用不同濃度的菌懸液與兔抗鴨源雞桿菌陽(yáng)性血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，出現(xiàn)100%凝集現(xiàn)象的次高菌液稀釋度確定為鴨源雞桿菌抗原的最佳工作濃度。將該稀釋度菌液用石炭酸復(fù)紅染色，離心收集菌液，加入石炭酸復(fù)紅染色液至最佳工作濃度，充分搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 特異性試驗(yàn) 用鴨源雞桿菌染色抗原，分別與該菌的雞源陽(yáng)性血清、分離自健康雞的陰性血清，以及雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腺病毒等病原的陽(yáng)性血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，檢測(cè)其特異性，同時(shí)設(shè)立兔血清陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和稀釋液對(duì)照。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 用本試驗(yàn)建立的鴨源雞桿菌平板凝集試驗(yàn)方法，對(duì)采集的460 份開產(chǎn)母雞血清進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合病原分離結(jié)果初步判斷鴨源雞桿菌感染情況。

2 結(jié)果

2.1 平板凝集試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示：兔抗陽(yáng)性血清與鴨源雞桿菌抗原液混合后發(fā)生100%凝集，而陰性血清、鴨源雞桿菌抗原液和0.5%石炭酸生理鹽水稀釋液與鴨源雞桿菌抗原液混合后均不凝集。

圖1 鴨源雞桿菌染色抗原凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.2 抗原最佳工作濃度

將5 個(gè)濃度梯度的抗原液分別與兔抗鴨源雞桿菌陽(yáng)性血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。結(jié)果（表1）顯示：當(dāng)抗原濃度為5×109CFU/mL 時(shí)，抗原與血清凝集最佳，體系充分反應(yīng)，液體透明，凝集顆粒均勻分布于液滴表面，由此確定抗原的最佳工作濃度為5×109CFU/mL。

表1 鴨源雞桿菌抗原最佳工作濃度

2.3 抗原特異性檢測(cè)

特異性檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，石炭酸復(fù)紅染色液染色的抗原與雞源陽(yáng)性血清產(chǎn)生明顯凝集，而與雞源陰性血清以及雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腺病毒等病原的陽(yáng)性血清均不凝集。

圖2 鴨源雞桿菌染色抗原凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)來(lái)自全國(guó)不同地區(qū)的460 份臨床血清樣品，采用建立的平板凝集試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（表2）顯示：①各地區(qū)鴨源雞桿菌血清抗體的陽(yáng)性率從0～100%各不相同，不同品種雞均有感染。②蛋雞和蛋種雞陽(yáng)性率大多高于白羽肉種雞，大部分人工授精的蛋種雞和肉種雞陽(yáng)性率高達(dá)100%。③一些籠養(yǎng)種雞，在3～5 輪人工授精之后表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)蛋率或受精率下降現(xiàn)象，其中白羽肉種雞主要表現(xiàn)為受精率下降，而蛋種雞主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率下降。④開產(chǎn)后“假母雞”無(wú)產(chǎn)蛋高峰，且存在輸卵管不發(fā)育或充盈透明液體現(xiàn)象。⑤人工授精的蛋種雞和肉種雞鴨源雞桿菌血清抗體陽(yáng)性率與鴨源雞桿菌分離率完全一致，“假母雞”鴨源雞桿菌血清抗體陽(yáng)性率略低于鴨源雞桿菌分離率。

表2 各地區(qū)雞場(chǎng)鴨源雞桿菌血清抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前臨床上主要用PCR 和病原分離的方法進(jìn)行鴨源雞桿菌的病原學(xué)診斷[7-8]，用ELISA 方法進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)[6]。以上方法雖然特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，但細(xì)菌培養(yǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)條件比較苛刻，成本較高且不易操作，難以在基層養(yǎng)禽場(chǎng)推廣應(yīng)用。本研究建立的平板凝集試驗(yàn)方法對(duì)試驗(yàn)環(huán)境要求不高，但結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便快捷、易掌握、成本低，可用于快速診斷，適合于基層養(yǎng)殖場(chǎng)使用，亦可輔助實(shí)驗(yàn)室開展大規(guī)模血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查。本研究選用鴨源雞桿菌YT-1 株作為抗原，能特異性地針對(duì)該菌引起的產(chǎn)蛋下降現(xiàn)象進(jìn)行血清學(xué)診斷，制備的抗原能特異性檢測(cè)出鴨源雞桿菌陽(yáng)性血清，可用于不同地區(qū)雞群的鴨源雞桿菌流行病學(xué)調(diào)查。

對(duì)比不同雞群的鴨源雞桿菌平板凝集檢測(cè)結(jié)果與病原分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法下人工授精的蛋種雞和白羽肉種雞檢測(cè)結(jié)果完全一致，“假母雞”的平板凝集檢測(cè)結(jié)果略低于病原分離結(jié)果。在實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物機(jī)體往往在感染病原一定時(shí)間后，血清抗體才會(huì)轉(zhuǎn)陽(yáng)，因此平板凝集試驗(yàn)的結(jié)果要比病原分離的結(jié)果稍滯后[9]，但整體上并不影響結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性。本研究表明，不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果有一定差異，因此應(yīng)根據(jù)研究目的選擇合適的檢測(cè)方法。對(duì)于臨床診斷高度疑似病例，經(jīng)平板凝集檢測(cè)為陰性的應(yīng)采取病原分離展開進(jìn)一步檢測(cè)，以提高臨床診斷率，避免出現(xiàn)漏診與誤診現(xiàn)象。

本研究對(duì)來(lái)自全國(guó)不同地區(qū)的460 份血清進(jìn)行了鴨源雞桿菌血清流行病學(xué)篩查，初步了解了我國(guó)雞群中鴨源雞桿菌的流行情況，為后續(xù)加強(qiáng)對(duì)該病的綜合防控提供了依據(jù)。在被調(diào)查的14 個(gè)雞場(chǎng)中，有12 個(gè)雞場(chǎng)為鴨源雞桿菌抗體陽(yáng)性場(chǎng)，說(shuō)明鴨源雞桿菌感染在雞群中比較普遍，這與李喬晶等[10]的研究結(jié)果一致。不同品種蛋雞血清鴨源雞桿菌抗體陽(yáng)性率為18.2%～42.0%，而非人工授精白羽肉種雞鴨源雞桿菌陽(yáng)性率均在5%以內(nèi)，造成這種差異的原因可能是白羽肉種雞較蛋雞的飼養(yǎng)管理水平和生物安全水平高，這與Bojesen 等[11]、Lozica 等[12]對(duì)丹麥不同飼養(yǎng)方式健康產(chǎn)蛋雞的調(diào)查結(jié)果相似。在一些無(wú)產(chǎn)蛋高峰雞群的輸卵管內(nèi)分離到一定量的鴨源雞桿菌，且這些雞的輸卵管不發(fā)育或發(fā)育不完全（假母雞），這與Nassik 等[13]、王川慶等[14]的研究結(jié)果一致，表明該菌影響的靶器官主要是生殖系統(tǒng)，并可能參與了雞傳染性支氣管炎病毒對(duì)雛雞早期生殖系統(tǒng)的損傷過(guò)程。前期國(guó)內(nèi)外研究多認(rèn)為，該病原菌主要與蛋雞產(chǎn)蛋下降有關(guān)[15-16]，而缺少對(duì)種雞所產(chǎn)種蛋受精率的研究和報(bào)道。本研究通過(guò)血清學(xué)診斷技術(shù)揭示了該病原菌在種雞上的危害，與實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果相一致[3]。種雞人工授精技術(shù)是提高公雞利用率和母雞受精率，減少養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)雞效益的重要途徑。該檢測(cè)技術(shù)是現(xiàn)代種雞生產(chǎn)中極為重要的技術(shù)支撐，但應(yīng)注意采精和授精過(guò)程中的無(wú)菌操作以及種公雞是否攜帶致病原等，綜合做好雞群的健康管理是應(yīng)用該技術(shù)的重要前提。國(guó)外考慮到動(dòng)物福利等因素，不施行人工授精技術(shù)，因此鮮有該病在種雞上的報(bào)道。