魚歡，張昂，馬永忠，宗迎，馮丁山，吉訓(xùn)志，秦曉威*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南萬寧 571533）（2.海南省疾病預(yù)防控制中心，海南?？?570203）

香露兜（Pandanus amaryllifoliusRoxb.），別名斑蘭葉、斑斕葉、香蘭葉、板蘭香、碧血樹，屬露兜樹科（Pandanaceae）露兜樹屬（Pandanus）的多年生常綠草本植物[1]，主產(chǎn)于斯里蘭卡、馬來西亞、泰國、印度和菲律賓等東南亞國家[2]，我國于20 世紀(jì)50 年代，在海南省引種試種成功[3,4]。香露兜葉片天然散發(fā)一種“粽子香味”香味清新淡雅，被譽(yù)為“東方香草”，鮮葉可直接作為食用材料，主要用于制作菜肴和食物香料，在東南亞國家居民中已有長期的食用歷史[5-7]。目前市場銷售的香露兜產(chǎn)品以鮮葉、酊劑等原料以及中間品為主，但是普遍存在保質(zhì)期短或價(jià)格高昂等問題[3,8]。時(shí)至今日，使用真空冷凍干燥以及超微粉碎等方式，以香露兜葉片為基源制作的香露兜粉，具有耐儲運(yùn)、易加工、低成本等優(yōu)勢，已成為制作糕點(diǎn)、冰淇淋、糖果等的純天然食品原料之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景[8,9]。

目前國內(nèi)外關(guān)于香露兜粉等產(chǎn)品的研究主要集中于其化學(xué)成分及功效等方面[10-12]，例如香露兜粉富含2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）、角鯊烯、亞油酸、草蒿腦和甾醇等活性成分，具有增強(qiáng)細(xì)胞活力、加快新陳代謝、提高人體免疫力，抗病毒以及抑制癌細(xì)胞生長等作用[13-17]。但是，針對香露兜粉的食用安全性，僅有研究表明香露兜粉不具有母體毒性、胚胎毒性和致畸作用[18,19]，但是仍缺乏包括亞慢性毒性、急性毒性和遺傳毒性研究在內(nèi)的安全性評估。因此，本研究在前期毒理學(xué)安全性評價(jià)基礎(chǔ)上依照GB 15193.13-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 90 天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[20]的要求，開展90 d 經(jīng)口毒性試驗(yàn)，通過觀測大鼠生長發(fā)育、生化指標(biāo)以及組織病理性檢查，全面評價(jià)香露兜粉的亞慢性毒性，為了解香露兜粉作為食品原料的食用安全性以及香露兜粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)毒理學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 受試物

香露兜粉為綠色粉末狀固體，由新鮮香露兜葉洗凈、晾干、切段后采用真空冷凍或微波干燥，經(jīng)超微粉碎，過200 目篩后制成。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀（SYSTEM XT-2000i），日本希森美康公司；全自動(dòng)生化分析儀（BECKMAN COULTER AU680），美國貝克曼庫爾特公司；全自動(dòng)凝血分析儀（SYSMEX CS-2000），日本希森美康公司；尿液分折儀（URIT-500B），桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司；病理檢測設(shè)備等。

主要試劑：總蛋白（TP）、白蛋白（ALB)、尿素（UREA）、血糖（GLU）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、膽堿酯酶（CHE）、總膽汁酸（TBA）、尿酸（UA）、磷（P）、鈣（Ca）等試劑盒購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；肌酐（Cr）等試劑盒購自德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司；氯（Cl）、鉀（K）、鈉（Na）等試劑盒購自美國貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter）。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

試驗(yàn)動(dòng)物：選無特定病原體（SPF 級）SD 大鼠100 只，雌雄各半，雌鼠體重80 g 左右、雄鼠體重82 g 左右。大鼠和飼料由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2014-0011。試驗(yàn)動(dòng)物使用單位為湖南省疾病預(yù)防控制中心，許可證號為SYXK(湘)2015-0012號。試驗(yàn)環(huán)境為屏障環(huán)境，試驗(yàn)期間環(huán)境溫度22℃～25℃，濕度46%～52%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 劑量分組

根據(jù)前期調(diào)查，在文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)中估算東南亞民眾平均每日食用香露兜粉劑量以20 g 為參考（平均體重以60 kg 計(jì)算），本研究根據(jù)香露兜粉的特性設(shè)計(jì)受試物低、中、高劑量組，分別為2.00 g/kg BW、4.00 g/kg BW、8.00 g/kg BW。采用將受試物摻入飼料給樣方式，大鼠每日攝食量按體重的8%折算，低、中、高三個(gè)劑量組分別按2.50%、5.00%、10.00%的比例添加樣品；對照組按10%比例在飼料中摻入甲基纖維素，使其與劑量組飼料營養(yǎng)水平保持一致；空白對照組僅飼以基礎(chǔ)飼料。大鼠連續(xù)飼養(yǎng)90 d。

1.2.2 動(dòng)物分組

取SD 大鼠100 只，雌雄各半，隨機(jī)分為5 組，即空白對照組、對照組及低、中、高三個(gè)受試物組，每組20 只，雌雄各半。

1.2.3 觀察指標(biāo)

一般臨床觀察：試驗(yàn)期間每天觀察動(dòng)物的一般臨床表現(xiàn)，并記錄動(dòng)物出現(xiàn)中毒的體征、程度和持續(xù)時(shí)間及死亡情況。觀察期為90 d。

體重和攝食：試驗(yàn)期間所有動(dòng)物，單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。每周加食3 次，記錄給食量和剩食量，前4 周每周稱2 次體重，之后每周稱體重1 次，計(jì)算進(jìn)食量和食物利用率。禁食前和進(jìn)食后（采血前）稱量動(dòng)物體重。

眼部檢查：在試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用檢眼鏡對高劑量組和對照組大鼠進(jìn)行眼部檢查，若發(fā)現(xiàn)高劑量組動(dòng)物有眼部變化，則對所有動(dòng)物進(jìn)行檢查。

血液學(xué)及血生化學(xué)檢查：試驗(yàn)結(jié)束后禁食過夜16 h 空腹采集抗凝血和非抗凝血，凝血用SYSMEX XT-2000i 全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測定血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞壓積（HCT），紅細(xì)胞（RBC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（Rtc）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)、WBC 分類；抗凝血分離血漿采用SYSMEX CS-2000 全自動(dòng)凝血分析儀測定凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（Fbg）；非抗凝血分離血清，用BECKMAN COULTER AU680全自動(dòng)生化分析儀測定ALT、AST、TP、ALB、CHOL、TG、GGT、CHE、TBA、ALP、UREA、UA、和GLU。

尿液檢查：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)給大鼠上代謝籠，收集尿液，進(jìn)行尿液常規(guī)檢查，包括外觀、尿蛋白、密度、pH、葡蔔糖和潛血等。

大體解剖與組織病理學(xué)檢查：試驗(yàn)結(jié)束頸椎脫臼處死所有動(dòng)物作大體檢查，稱腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、脾、腎、睪丸、附睪、子宮、卵巢重量，計(jì)算臟/體比值。先對高劑量組及對照組動(dòng)物進(jìn)行以下臟器組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。檢測臟器包括：腦、垂體、甲狀腺、胸、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺、膀胱等。必要時(shí)可加測脊髓（頸、胸、腰）、食道、唾液腺、頸淋巴結(jié)、氣管、動(dòng)脈、精囊腺和凝固腺、子宮頸、陰道、乳腺、骨和骨髓、坐骨神經(jīng)和肌肉、皮膚和眼球等組織器官。對肉眼可見的病變或可疑病變組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單方差分析對比多個(gè)試驗(yàn)組與對照組之間的各個(gè)指標(biāo)，以p<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 一般情況觀察結(jié)果

試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物生長發(fā)育、活動(dòng)正常，無異常行為和中毒癥狀，無死亡。根據(jù)動(dòng)物平均體重、攝食量和飼料中樣品含量，計(jì)算出各劑量組實(shí)際攝入樣品劑量為：雄鼠低、中、高劑量分別為2.20 g/kg BW、4.46 g/kg BW、8.89 g/kg BW；雌鼠低、中、高劑量分別為2.42 g/kg BW、4.83 g/kg BW、9.76 g/kg BW。

試驗(yàn)期間，最高劑量組雄鼠與雌鼠分別增重430.90 g 和266.60 g，總進(jìn)食量分別為2505.20 g 和2056.30 g，各劑量受試組雄、雌大鼠體重增長以及總進(jìn)食量與對照組相比無差異（表1）。最高劑量組總食物利用率分別為17.1%、12.9%，各劑量受試組雌、雄大鼠總食物利用率與對照組比較無差異（表1），上述結(jié)果表明香露兜粉對不同性別大鼠的體重、進(jìn)食量與食物利用率均無影響。

表1 不同香露兜粉受試下大鼠的體重、攝食量及食物利用率 Table 1 Body weight,food intake and food utilization of rats in different doses of Pandanus amaryllifoliusRoxb.powder (n=10)

2.2 香露兜粉對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間，最高劑量組雄、雌大鼠的血紅蛋白分別為145.00 和147.00 g/L、紅細(xì)胞總數(shù)為7.77×1012個(gè)/L 和7.85×1012個(gè)/L、紅細(xì)胞壓積均為0.43 L/L、網(wǎng)織紅細(xì)胞為3.87%和3.72%，各劑量組與對照處理相比不存在差異（表2），表明香露兜粉對大鼠血紅細(xì)胞沒有影響。最高劑量組雄、雌大鼠的血小板數(shù)分別為7.48×1012個(gè)/L 和7.66×1012個(gè)/L，各劑量組與對照相比同樣無差異（表2），表明香露兜粉不影響大鼠血小板數(shù)量。最高劑量組雄、雌大鼠的白細(xì)胞總數(shù)分別為7.35×109個(gè)/L 和8.57×109個(gè)/L，與對照組比較無顯著性差異，并且各劑量組雌、雄、雌大鼠的白細(xì)胞分類（淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞）與對照組比較無差異（表2），表明香露兜粉對大鼠的白細(xì)胞指標(biāo)沒有影響。上述結(jié)果證明香露兜粉不影響大鼠各項(xiàng)血液指標(biāo)。

表2 不同香露兜粉劑量下大鼠的血液學(xué)指標(biāo) Table 2 Hematological indexes of rats in different doses of Pandanus amaryllifoliusRoxb.powder (n=10)

2.3 香露兜粉對喂飼90 d 大鼠生化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間，最高劑量組雄、雌大鼠的總蛋白分別為63.92和62.30 g/L、白蛋白分別為33.30和32.11 g/L，并且各劑量組與對照組相比無差異（表3），表明香露兜粉對大鼠血液蛋白質(zhì)含量沒有影響。最高劑量組雄、雌大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶分別為47.11 和48.45 U/L、谷草轉(zhuǎn)氨酶分別為158.99 和159.65 U/L、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶分別為1.20 和1.16 U/L、堿性磷酸酶分別為140.90 和149.50 U/L、膽堿酯酶分別為203.69 和316.93 U/L，各劑量組與對照組相比不存在差異（表3），表明香露兜粉對大鼠血液酶沒有影響。最高劑量組雄、雌大鼠的膽固醇分別為1.88 和2.03 mmol/L、甘油三酯分別為1.00 和1.05 mmol/L、尿素分別為5.02 和5.26 mmol/L、血糖分別為5.1 和5.11 mmol/L、總膽汁酸分別為11.5 和10.1 μmol/L、肌酐分別為52.25 和50.79 μmol/L、尿酸分別為62.80 和62.97 μmol/L，各劑量組血液代謝指標(biāo)含量對照組比較無顯著性差異（表3），表明香露兜粉對大鼠的生化指標(biāo)沒有影響。

表3 不同香露兜粉劑量下大鼠的生化指標(biāo) Table 3 Biochemical indexes of rats in different doses of Pandanus amaryllifoliusRoxb.powder (n=10)

2.4 香露兜粉喂飼90 d 大鼠凝血指標(biāo)的變化

試驗(yàn)期間，各劑量組雄、雌大鼠的凝血酶原時(shí)間分別為9.30 和7.80 s、活化部分凝血活酶時(shí)間分別為15.20 和13.20 s、纖維蛋白原均為2.00 g/L、凝血酶時(shí)間分別為37.10 和34.80 s，各劑量組凝血指標(biāo)與對照組比較無顯著性差異（表4），表明香露兜粉對大鼠凝血指標(biāo)沒有影響。

表4 不同劑量香露兜粉下大鼠的凝血指標(biāo) Table 4 Blood coagulation indices of rats in different doses of Pandanus amaryllifoliusRoxb.powder (n=10)

2.5 香露兜粉喂飼90 d 大鼠臟器重量、臟器/體重比值的變化

試驗(yàn)期間，各劑量組雄、雌大鼠的腦重量分別為2.49 和1.98 g、心臟分別為1.63 和1.15 g、胸腺分別為0.50 和0.36 g、腎上腺分別為0.11 和0.09 g、肝臟分別為13.46 和8.41 g、腎臟分別為3.30 和2.25 g、脾臟分別為0.93 和0.74 g、睪丸/子宮分別為3.75 和0.80 g、附睪/卵巢分別為1.55 和0.15 g，各劑量組與對照組比較無顯著性差異（表5），表明香露兜粉對大鼠臟器重量沒有影響。

表5 不同劑量香露兜粉下大鼠的臟器重量（g）Table 5 Coagulation index organ weight and organ of rats in different doses of Pandanus amaryllifoliusRoxb.powder (n=10)

各劑量組雄、雌大鼠的臟器/體重比值與對照組比較無顯著性差異（表6），表明香露兜粉對大鼠臟器以及臟器/體重比值沒有影響。

表6 不同劑量香露兜粉下大鼠的臟器/體重比值（%）Table 6 Organ/ body weight ratio of rats in different doses of Pandanus amaryllifoliusRoxb.powder (n=10)

2.6 香露兜粉喂飼90 d 大鼠尿常規(guī)指標(biāo)及眼部的變化

試驗(yàn)?zāi)┢趯Ω鹘M大鼠進(jìn)行尿液常規(guī)檢查，各組動(dòng)物尿液外觀、尿蛋白、密度、pH 值、葡萄糖和潛血各項(xiàng)指標(biāo)，均未發(fā)現(xiàn)異常。用檢眼鏡對上述高劑量組和對照組的大鼠進(jìn)行眼部檢查（角膜、晶狀體、球結(jié)膜、虹膜），動(dòng)物角膜、虹膜清晰，晶狀體無渾濁，球結(jié)膜未見充血、水腫及其他異常表現(xiàn)。上述結(jié)果表明香露兜粉對大鼠代謝及眼部沒有影響。

2.7 香露兜粉對大鼠病理解剖檢查結(jié)果

共檢查對照組和各劑量組共100 只大鼠。剖檢后肉眼觀察，被毛整齊均勻、有光澤，無脫毛及污染現(xiàn)象。皮膚及黏膜無肉眼可見的色素、角化、貧血、黃疸、水腫、結(jié)節(jié)、出血、淤血、創(chuàng)傷、糜爛、潰瘍及疤痕等異常改變。乳腺、四肢及尾巴無缺損。眼、耳、鼻、口腔、肛門和外生器無異常分泌物、出血、損傷和其他改變。腹腔、胸腔無積液、無異物，腔壁組織未見異常。各組織器宮（肝、脾、胰、心臟、肺、胸腺、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、卵巢、子宮等）位置正常、外觀、形態(tài)、大小、色澤、質(zhì)地?zé)o肉眼可見的異常變化。腸袢之間無粘連，胃、大腸、小腸及盲腸無扭轉(zhuǎn)、出血、穿孔和壞死，淋巴結(jié)無腫大。胸膜無出血點(diǎn)、炎癥及粘連，心包液顏色、量、性質(zhì)正常，心外膜光滑無出血點(diǎn)。蛛網(wǎng)膜下腔無滲出物，腦表面無充血、淤血、出血和腫塊，腦、垂體、脊髓、甲狀腺、氣管、食管、頸部淋巴結(jié)、血管的形態(tài)、大小、色澤、質(zhì)地等無肉眼可見的異常改變。各劑量組雌雄大鼠的腦、心、肝、脾、肺、胃、腸、睪丸（卵巢）等所檢器官組織均未見明顯與試驗(yàn)因素有關(guān)的病理組織學(xué)變化。上述結(jié)果表明香露兜粉對大鼠器官組織沒有影響。

2.8 香露兜粉亞慢性毒性評價(jià)

香露兜粉90 d 經(jīng)口毒性試驗(yàn)是香露兜新食品原料安全風(fēng)險(xiǎn)評估中的重要一環(huán)，主要用于確定外來化合物的食用安全劑量，即健康指導(dǎo)值，為進(jìn)行該化合物的食用安全性評價(jià)與制定人食用的安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，對食品原料的安全性評價(jià)具有重要意義。作者依據(jù)前期的毒理試驗(yàn)結(jié)果，按GB 15193.13-2015進(jìn)行設(shè)計(jì)和試驗(yàn)。在本實(shí)驗(yàn)室條件下，以2.50%、5.00%、10.00%的比例將香露兜粉摻入飼料喂飼大鼠90 d，根據(jù)飼料消耗量，計(jì)算出各劑量組實(shí)際攝入樣品劑量為：雄鼠低、中、高劑量分別為2.20 g/kg BW、4.46 g/kg BW、8.89 g/kg BW；雌鼠低、中、高劑量分別為2.42 g/kg BW、4.83 g/kg BW、9.76 g/kg BW。研究結(jié)果表明，香露兜粉各劑量組未發(fā)現(xiàn)明顯中毒現(xiàn)象，無死亡。各劑量組動(dòng)物生長發(fā)育良好，體重、增重、食物利用率、血常規(guī)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、凝血功能指標(biāo)、臟器重量及臟器/體重比值與對照相比均無差異。尿常規(guī)指標(biāo)、檢眼鏡檢查、大體解剖和組織病理檢查未見明顯與樣品有關(guān)的異常改變。上述結(jié)果表明香露兜粉本次90 d 經(jīng)口毒性試驗(yàn)的無可見有害作用劑量（NOAEL）值為雄鼠8.89 g/kg BW，雌鼠9.76 g/kg BW。

本研究為香露兜粉的食用安全評估提供了毒理學(xué)依據(jù)，為香露兜進(jìn)一步作為普通食品、保健食品以及新資源食品原料開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

2.9 香露兜粉的應(yīng)用展望

近年來，國內(nèi)香露兜產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，相關(guān)單位與企業(yè)圍繞香露兜產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，開展全產(chǎn)業(yè)鏈技術(shù)研發(fā)，已具備一定的技術(shù)儲備。在種植環(huán)節(jié)，由于香露兜不僅具有粗生易種，耐蔭蔽，耐高濕等特性，還能夠單作畝產(chǎn)鮮葉可達(dá)4000 kg 以上，具有好育苗、好種植、好管理、好采收、好加工和好前景等“六個(gè)好”特點(diǎn)，技術(shù)門檻低，經(jīng)濟(jì)價(jià)值髙。單次種植多年受益，適宜于發(fā)展成為中國南方熱區(qū)特色鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)，助力相關(guān)農(nóng)戶脫貧致富。

在加工環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)上，東南亞人民以及海南等地華僑常將香露兜新鮮葉片磨碎榨汁，加入米中蒸食，制作特色糕點(diǎn)、甜品和冷飲等特色小吃。但香露兜鮮葉不耐儲運(yùn)，且不易加工，無法滿足人民群眾對香露兜產(chǎn)品日益增長的多樣化需求。因此，采用真空冷凍或微波干燥，經(jīng)超微粉碎而制作的香露兜粉能夠克服上述產(chǎn)業(yè)困境，廣泛應(yīng)用于烘焙、餐飲、香精香料等行業(yè)，拓展香露兜的應(yīng)用場景，為消費(fèi)者提供更加豐富多彩的特色產(chǎn)品，滿足人們對個(gè)性化綠色農(nóng)產(chǎn)品的需求。

3 結(jié)論

在本研究中未見香露兜粉樣品具有亞慢性毒性作用，基于香露兜粉90 d 經(jīng)口毒性試驗(yàn)NOAEL 為雄鼠8.89 g/kg BW，雌鼠9.76 g/kg BW。