王桃紅，張云雙，姜曉林，管志斌，賈光群,，張進杰,，崔宗巖,*

（1.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北秦皇島 066004）（2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南昆明 650000）（3.云南澳洲堅果蜂蜜研究中心，云南西雙版納 666100）

蜂蜜因為具有較高的營養(yǎng)價值[1,2]和保健功效[3-5]，已成為人們?nèi)粘ＯM的主要食品之一。蜂蜜的風味是評價蜂蜜質(zhì)量品質(zhì)的重要因素，也是消費者選擇蜂蜜時考慮的因素。蜂蜜的特殊風味主要依賴于揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)[6]，氣候和貯藏條件也會對其產(chǎn)生影響[7]。蜂蜜中的揮發(fā)性成分所占含量較低，但數(shù)量較多，包括醇類、芳香族類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類、酯類化合物等，主要類別是醛類[8]、萜烯及其衍生物[9]。蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的[10]，所以每種單花蜜都有其獨特的揮發(fā)性成分體系和特征揮發(fā)性成分，因此蜂蜜揮發(fā)性成分及其特征揮發(fā)性物質(zhì)可以作為蜜種識別的依據(jù)[11]。

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）作為一種高效的萃取方法，靈敏度高、檢測時間短、不引入萃取溶劑污染樣品[12]。Alissandrakis 等[13]比較了水蒸氣蒸餾法(Hydrodistillation，HD)、同時蒸餾萃取法（Simultaneous Steam Distillation and Solvent Extraction，SDE）、超聲波輔助萃取法（Ultrasound-assisted Extraction，USE）和SPME 四種不同的前處理方法，研究結(jié)果表明SPME 更適用于蜂蜜中揮發(fā)性成分的提取。頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Headspace-solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)以其特有的優(yōu)勢已廣泛應用于蜂蜜中揮發(fā)性成分的測定[11,14]。

云貴地區(qū)氣候類型眾多，區(qū)域差異明顯，土壤環(huán)境適宜，適合多種蜜源植物生長[15]，所以云南地區(qū)蜜源植物種類繁多，且花期較長，其中主要的特色蜂蜜有苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜等。目前對這三種蜂蜜揮發(fā)性風味的報道較少，僅見Grace 等[16]對澳大利亞澳洲堅果蜜風味進行感官分析，發(fā)現(xiàn)澳洲堅果蜜主要呈柑橘味、花香味、糖果味及辛辣的后味等，但未對具體的呈香成分進行系統(tǒng)性研究。國內(nèi)對苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜揮發(fā)性成分的研究尚未見報道。本文采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對云南產(chǎn)區(qū)的三種特色蜂蜜（苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜）的揮發(fā)性成分進行測定，對其揮發(fā)性成分組成進行了系統(tǒng)分析，并對比分析了苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜揮發(fā)性成分的差異。

1 材料與方法

1.1 蜂蜜樣品

研究所用蜂蜜樣品均是在三種蜜源植物開花流蜜時節(jié)采自云南各主要產(chǎn)區(qū)，采集地點均選擇三種蜜源植物無交叉的單一蜜源產(chǎn)區(qū)，樣品直接從一線蜂農(nóng)手中獲得。樣品在采集前經(jīng)過嚴格清框處理，均屬于二次及以上次數(shù)搖蜜，以保證獲得的樣品為單一花種純正蜂蜜。樣品檢測前一直置于4℃條件下保存。其中包括苕子蜜7 份，澳洲堅果蜜7 份，橡膠蜜7份。詳細信息見表1。

表1 蜂蜜樣品采集信息表 Table 1 Sample information of collected honeys

1.2 試劑與材料

固相微萃取纖維為50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美國Sigma-Aldrich Supelco 公司，實驗前在270℃條件下，老化30 min；20 mL 頂空瓶，配置硅膠/聚四氟乙烯隔墊和20 mm 鐵蓋，德國Gerstel 公司；壓蓋器和啟蓋器，CNW 公司；實驗用水為超純水。

1.3 儀器設(shè)備

7890B-5977B 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置分流/不分流進樣口和固相微萃取專用襯管。美國Agilent 公司；MPS 多功能樣品前處理平臺，配置自動化頂空固相微萃取手柄，德國Gerstel 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理方法

準確稱取2.0±0.1 g 蜂蜜樣品于20 mL 頂空瓶中，密封后置于樣品前處理平臺上進行固相微萃取。

1.4.2 SPME 萃取條件

本文選擇實驗室優(yōu)化出來的萃取條件進行實驗[17]，其具體參數(shù)如下：萃取纖維為50/30 μm DVB/CAR/ PDMS；萃取溫度60℃；萃取時間45 min；平衡時間10 min；震蕩速率250 r/min；進樣口解析時間5 min。

1.4.3 儀器條件

色譜條件：Agilent DB-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序為初始溫度40℃保持3 min，以3℃/min 升溫至160℃，然后以10℃/min升溫至270℃，保持6 min，總運行時間為60 min。載氣為高純氦，流量1.0 mL/min，進樣口溫度270℃，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（Electron Ionization，EI，70 eV），離子源溫度230℃；傳輸線溫度270℃；全掃描模式，掃描范圍為25～450m/z。

1.4.4 定性定量方法

將各組分質(zhì)譜圖經(jīng)NIST14 譜庫檢索，選取正相和反相匹配度均大于800，且相似度得分值最高的化合物，同時結(jié)合保留指數(shù)（Retention index，RI）值、標準品驗證等方法輔助定性。采用面積歸一化法測定各揮發(fā)性成分的相對含量。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。將數(shù)據(jù)導入Simca 14.1 軟件分別進行主成分和偏最小二乘法判別分析。用Origin 9.1 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 云南蜂蜜中揮發(fā)性成分分析

采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)測定云南特色蜂蜜（苕子蜜、澳洲堅果蜜、橡膠蜜）中揮發(fā)性成分，苕子蜜、澳洲堅果蜜、橡膠蜜的總離子流色譜圖如圖1所示。三種蜂蜜樣品中共檢測出105 種揮發(fā)性成分，共有揮發(fā)性物質(zhì)22 種。如表2 所示，三種蜂蜜的揮發(fā)性種類組成相似，主要包括醇類、酸類、醛類、酯類、芳香類等物質(zhì)。共有物質(zhì)中含量較高的成分為順式芳樟醇氧化物、壬醛、苯乙醛、乙酸、乙醇等。

圖1 三種云南特色蜂蜜揮發(fā)性成分總離子流圖 Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in three kinds of characteristic honeys from Yunnan province

對比苕子蜜、澳洲堅果蜜、橡膠蜜揮發(fā)性成分種類和相對含量（圖2），發(fā)現(xiàn)三種蜂蜜存在一定的差異：澳洲堅果蜜的醇類物質(zhì)占比最高，而苕子蜜和橡膠蜜則以醛類物質(zhì)為其最主要成分；苕子蜜的芳香類、酸類、烷烴類和酯類成分相對更加豐富；澳洲堅果蜜的萜烯類物質(zhì)含量遠高于另外兩個蜜種，但其酮類物質(zhì)則呈現(xiàn)完全相反的趨勢，苕子蜜和橡膠蜜中酮類物質(zhì)明顯高于澳洲堅果蜜。

圖2 三種云南特色蜂蜜中揮發(fā)性成分的種類及相對含量 Fig.2 Volatile compounds types and amount inthree kinds of characteristic honeys from Yunnan province

揮發(fā)性成分是影響蜂蜜風味的最重要因素之一，各類型蜂蜜的揮發(fā)性成分體系是其風味的重要來源。云南三種蜂蜜的具體揮發(fā)性成分及特點分別描述如下：

苕子蜜中共檢測出61 種揮發(fā)性成分，主要由醛類（28.85%）、酸類（22.43%）和醇類（16.47%）組成，這3 類揮發(fā)性成分的含量占揮發(fā)性成分的67.75%，與已有報道的棗花蜜[18]中主要的揮發(fā)性種類一致。相對含量最高的物質(zhì)分別為乙酸（13.20%）、正壬醛（12.06%）和正已酸（4.09%）。與另外兩個蜜種蜂蜜相比，苕子蜜中獨有的特征揮發(fā)性成分包括丁香醛B（3.56%）、3-甲基-3-丁烯-1-醇（2.22%）、正己烷（1.97%）和異戊烯醇（1.23%）等。

澳洲堅果蜜中共檢測出55 種揮發(fā)性成分，主要由醇類（59.17%）、萜烯類（17.39%）和醛類（9.63%）組成，這3 類揮發(fā)性成分的含量占揮發(fā)性成分的86.20%。與Vilma[8]和Praetinee 等[9]報道醛類和萜烯類物質(zhì)是蜂蜜揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)一致。相對含量最高的物質(zhì)分別為順式-氧化芳樟醇（30.86%）、反式呋喃芳樟醇氧化物（20.06%）和反式-芳樟醇3,7-氧化物（10.66%）。與另外兩個蜜種蜂蜜相比，澳洲堅果蜜中獨有的特征揮發(fā)性成分主要包括反式-芳樟醇3,7-氧化物（10.66%）、脫氫芳樟醇（2.91%）、丁香醛C（1.31%）和某未知成分（RT：17.64）（3.45%）等。

橡膠蜜中共檢測出62 種揮發(fā)性成分，主要由醛類（38.06%）、醇類（32.40%）和酸類（10.77%）組成，這3 類揮發(fā)性成分的含量占揮發(fā)性成分的81.23%。相對含量最高的物質(zhì)分別為壬醛（21.77%）、反式呋喃芳樟醇氧化物（13.07%）和順式芳樟醇氧化物（8.84%）。與另外兩個蜜種蜂蜜相比，橡膠蜜中獨有的特征揮發(fā)性成分主要包括芳樟醇氧化物（4.67%）、某未知成分（RT：12.33）（1.51%）、5-（1-甲基乙基）-雙環(huán)[3.1.0]正己烷-2-酮（1.43%）和異佛爾酮（1.07%）等。

進一步篩選出苕子蜜、澳洲堅果蜜、橡膠蜜中主要揮發(fā)性成分，進行統(tǒng)計和對比分析（圖3），結(jié)果表明：壬醛在苕子蜜、堅果蜜和橡膠蜜中的含量存在極顯著差異（p<0.01），在苕子蜜和橡膠蜜中含量較高，含量分別為12.06%和21.77%，澳洲堅果蜜中含量較少，僅為1.09%。乙酸在苕子蜜（13.20%）中的含量顯著高于澳洲堅果蜜（4.42%）和苕子蜜（3.68%），是苕子蜜中主要的酸類物質(zhì)。芳樟醇類物質(zhì)在堅果蜜中含量較高，主要包含順式芳樟醇氧化物、反式呋喃芳樟醇氧化物和反式芳樟醇3,7-氧化物，含量分別為30.86%、20.06%和10.66%。順式芳樟醇氧化物在三種蜜中的含量存在極顯著差異（p<0.01），堅果蜜含量（30.86%）遠高于苕子蜜（0.67%）和橡膠蜜（8.84%），反式呋喃芳樟醇氧化物在澳洲堅果蜜（21.06%）和橡膠蜜（13.07%）中被檢出，且兩者含量存在極顯著性差異，澳洲堅果蜜中含量較高。反式芳樟醇3,7-氧化物僅在堅果蜜（10.66%）中存在，且所有樣品中含量較高，已有研究報道芳樟醇類物質(zhì)在椴樹蜜[11]、棗花蜜[18]、荔枝蜜[19]、洋槐蜜[11,20]、柑橘蜜[14]和蕎麥蜜[17]均被檢出，順式芳樟醇氧化物為荔枝蜜中含量較高的物質(zhì)，含量為17.69%，但反式芳樟醇3,7-氧化物在荔枝蜜中含量僅為1.68%[19]，柑橘蜜、蕎麥蜜和棗花蜜中均未檢出[14,17,18]，明顯低于堅果蜜的平均相對含量，這些結(jié)果表明反式芳樟醇3,7-氧化物為澳洲堅果蜜的特征揮發(fā)性成分。苯乙醛在苕子蜜（2.20%）、澳洲堅果蜜（3.40%）和橡膠蜜（4.77%）中均有檢出，含量無顯著性差異。已有報道苯乙醛在蕎麥蜜[17]、荔枝蜜[19]和油菜蜜[21]中均有檢出，含量分別為1.59%、0.68%和0.82%，是蜂蜜中常見的揮發(fā)性成分。敖常偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)苯乙醛在棗花蜜中含量為11.20%，是棗花蜜中的主要揮發(fā)性成分，含量明顯高于苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜，進一步證明不同蜜源植物蜂蜜揮發(fā)性成分存在一定差異，也表明蜂蜜中的揮發(fā)性成分可以作為蜜源植物區(qū)分鑒別的依據(jù)[11,14,20]。

圖3 三種云南特色蜂蜜中主要揮發(fā)性成分相對含量差異 Fig.3 Differences in the relative amounts of main Volatile compounds in three kinds of characteristic honeys from Yunnan province

2.2 揮發(fā)性成分PCA 和PLS-DA 分析

主成分分析是一種常見的多元數(shù)理統(tǒng)計方法[22]，通過降低數(shù)據(jù)集的維數(shù)[23]，識別變量和樣本之間的差異和關(guān)聯(lián)[11]。為了更進一步的分析苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜中揮發(fā)性成分之間的差異，對21 批云南蜂蜜樣品中揮發(fā)性成分含量數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA），苕子蜜、橡膠蜜和澳洲堅果蜜被有效進行分類。通過PCA 分析，由圖4 可以看出，主成分1 和主成分2 的方差貢獻率分別為33.49%和24.31%，所有樣品點均在95%置信區(qū)間內(nèi)，并呈現(xiàn)良好的聚類，橡膠蜜被分在PC2 的正半軸上，苕子蜜和澳洲堅果蜜被分在PC2的負半軸上。另外，苕子蜜和澳洲堅果蜜又分別被分在PC1 的負半軸和正半軸上。說明云南三種特色蜂蜜揮發(fā)性成分之間存在差異。

圖4 三種云南特色蜂蜜中揮發(fā)性化合物PCA 得分圖 Fig.4 Scores for PCA of honey samples of three kinds of characteristic honeys from Yunnan province

為進一步驗證云南三種特色蜂蜜揮發(fā)性成分的組間差異，采用揮發(fā)性成分含量數(shù)據(jù)構(gòu)建PLS-DA 模型進行分析。PLS-DA 是基于偏最小二乘回歸的一種有監(jiān)督的分類判別方法[24]。由圖5 可知，該模型共提取出6 個主成分，前2 個主成分累計貢獻率參數(shù)R2Y 達0.93，預測能力參數(shù)Q2 達0.92，所以PLA-DA 模型具有更強的解釋能力和預測能力。由圖6 可知，通過PLS-DA 分析，澳洲堅果蜜、苕子蜜和橡膠蜜被100%準確分類，與PCA 分析的結(jié)果一致。說明了云南省三種特色蜂蜜中揮發(fā)性成分存在顯著差異，更進一步證明了蜂蜜中的揮發(fā)性成分可以作為蜜種分類判別的依據(jù)[11,14,20]。通過對云南特色蜂蜜揮發(fā)性成分的測定可以為云南特色蜂蜜的品質(zhì)評價和識別開發(fā)提供一定的技術(shù)支持。

圖5 PLS-DA 提取主成分得分圖 Fig.5 Scores plots for principal components extracted by PLS-DA

圖6 三種云南特色蜂蜜中揮發(fā)性化合物PLS-DA 得分圖 Fig.6 Scores for PLS-DA of honey samples of three kinds of characteristic honeys from Yunan province

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對云南三種特色蜂蜜（苕子蜜、澳洲堅果蜜和橡膠蜜）中的揮發(fā)性成分進行了測定，所有蜂蜜樣品中共檢測出105 種物質(zhì)，苕子蜜中檢出61 種，澳洲堅果蜜中檢出55 種，橡膠蜜中檢出62 種，三種蜜源蜂蜜共有揮發(fā)性物質(zhì)22 種。通過對比分析，發(fā)現(xiàn)不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分存在差異。苕子蜜的主要揮發(fā)性成分為醛類、酸類和醇類，含量較高的物質(zhì)為正壬醛和乙酸。澳洲堅果蜜的主要揮發(fā)性成分為醇類、萜烯類和醛類，含量較高的物質(zhì)為順式-氧化芳樟醇、反式呋喃芳樟醇氧化物,特征揮發(fā)性成分為反式芳樟醇3,7-氧化物。橡膠蜜主要揮發(fā)性成分為醛類、醇類和酸類，含量較高的物質(zhì)為壬醛和呋喃芳樟醇氧化物。基于三種蜂蜜揮發(fā)性成分構(gòu)建的PLS-DA 模型前2 個主成分累計貢獻率參數(shù)R2Y 達0.93，預測能力參數(shù)Q2 達0.92，預測能力和解釋能力較高，可實現(xiàn)澳洲堅果蜜、苕子蜜和橡膠蜜100%準確分類。結(jié)果表明，澳洲堅果蜜、苕子蜜和橡膠蜜揮發(fā)性成分差異顯著，據(jù)此構(gòu)建的PLS-DA 模型可以實現(xiàn)云南這三種特色蜂蜜的有效分類鑒別，可以為云南特色蜂蜜的品質(zhì)評價和識別開發(fā)提供一定的借鑒參考。