王紫薇，蔡吳丹，閆景坤

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

可德蘭多糖是一種由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖[1]，在食品領(lǐng)域可用作穩(wěn)定劑、增稠劑等[2]，但由于其剛性的三螺旋結(jié)構(gòu)使其不溶于冷水[3]，進(jìn)而限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。可德蘭多糖分子內(nèi)和分子間氫鍵的相互作用是其不溶于水的主要原因，但是可德蘭多糖分子鏈上又存在大量的羥基[4]，可通過(guò)對(duì)羥基進(jìn)行化學(xué)修飾，來(lái)獲得具有獨(dú)特理化性質(zhì)和生物活性的可德蘭多糖衍生物。目前，可德蘭多糖的化學(xué)改性方法主要包括羧甲基化[5]、氧化[6]、硫酸化[7,8]、磷酸化、陽(yáng)離子化等。

近年來(lái)，多糖-酚酸接枝共聚的方法因其具備不僅能結(jié)合酚酸類(lèi)化合物和多糖的優(yōu)點(diǎn)，還可以賦予接枝共聚物新的功能與特性的特點(diǎn)而備受關(guān)注。目前，用于制備接枝共聚物的方法主要包括：碳二亞胺化學(xué)交聯(lián)法、酶催化接枝法、電化學(xué)法和自由基介導(dǎo)接枝法[9]。其中，自由基介導(dǎo)接枝法因具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、安全以及可避免酚酸在反應(yīng)過(guò)程中的降解和氧化等優(yōu)點(diǎn)[10]，已成功用于許多多糖-酚酸接枝共聚物的制備，如菊粉-沒(méi)食子酸[11]、殼聚糖-咖啡酸[12]、殼聚糖-阿魏酸[13]、普魯蘭-阿魏酸[14]等。

因此，為了改善可德蘭多糖的理化特性，拓寬其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。本文采用自由基介導(dǎo)的接枝方法制備可德蘭多糖-阿魏酸（FA）接枝共聚物。通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究FA 添加量、H2O2濃度、Vc添加量及反應(yīng)時(shí)間對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物接枝率和得率的影響；在此基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化可德蘭多糖-FA 接枝共聚物制備的工藝參數(shù)，確定最佳制備工藝條件和最高接枝率。此外，通過(guò)紫外光譜和紅外光譜對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物進(jìn)行定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可德蘭多糖購(gòu)于日本W(wǎng)ako Pure 化學(xué)公司；FA、福林酚試劑（Folin-Ciocalteu）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；過(guò)氧化氫（H2O2）購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；維生素C（Vc）、無(wú)水Na2CO3、NaOH 等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

TE-124 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BS-124S 型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHS-3C pH 計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Nexus670 紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet 儀器公司；UV-1601 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 可德蘭多糖溶液的制備

可德蘭多糖溶液的制備參照Li 等[15]的堿溶酸中和處理的方法，并稍作修改。將2 g 可德蘭多糖溶解在200 mL 1.0 mol 的NaOH 溶液中，在室溫條件下磁力攪拌6 h，直至可德蘭多糖完全溶解，然后用等體積的1.0 mol HCl 溶液將溶液調(diào)至中性，放置4℃冰箱過(guò)夜，使其充分水化，備用。

1.2.2 可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的制備

可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的制備參照Liu 等[16]的方法，并稍作修改。準(zhǔn)確量取25 mL 5 mg/mL 水化完全的可德蘭多糖溶液于三頸瓶中，分別加入不同質(zhì)量的Vc 和FA，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下先磁力攪拌30 min，然后逐滴加入1 mL 不同濃度的H2O2溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)不同的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，用4 倍體積95%乙醇沉淀，放入4℃冰箱中靜置過(guò)夜，8000 r/min 離心10 min，收集沉淀，用去離子水復(fù)溶、蒸餾水透析（分子截留量：6～8 ku）48 h，凍干，即得接枝共聚物固體。接枝共聚物的得率按式1 計(jì)算：

其中，m1為可德蘭多糖的添加量，mg；m2為FA 的添加量，mg；M為凍干后接枝共聚物的質(zhì)量，mg。

1.2.3 接枝率的測(cè)定

根據(jù)Folin-Ciocalteu 法測(cè)定可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率[17]。準(zhǔn)確配制0.1 mg/mL 的樣品溶液15 mL，取4 mL 樣品溶液于試管中，加入1 mL 0.2 M Folin-Ciocalteu 試劑，充分混勻，3 min 后，加入3 mL 2%的Na2CO3溶液，間斷性振搖2 h。在4000 r/min 的條件下離心8 min，于760 nm 下測(cè)定樣品溶液的吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次。在相同條件下，制作FA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0257x+0.0082（R2=0.9991）。接枝率按式2 計(jì)算得到。

其中，m1為可德蘭多糖-FA 接枝共聚物中FA 的質(zhì)量；m2為接枝共聚物的質(zhì)量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 FA 的添加量

保持Vc 的加入量（50 mg）、H2O2濃度（5 mol/L）以及可德蘭多糖溶液的濃度與體積（25 mL，5 mg/mL）不變，根據(jù)FA 與可德蘭多糖的質(zhì)量比，添加不同質(zhì)量的FA（100、150、200、250、300 mg），在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下反應(yīng)8 h 后，得到五種不同的混合溶液，分別經(jīng)過(guò)醇沉、離心、復(fù)溶、透析、凍干，得到不同F(xiàn)A 添加量的可德蘭多糖-FA 接枝共聚物。計(jì)算接枝共聚物的得率，并采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定接枝共聚物的接枝率。

1.2.4.2 Vc 的添加量

保持FA 的加入量（200 mg）、H2O2濃度（5 mol/L）和可德蘭多糖溶液的體積與濃度（25 mL，5 mg/mL）不變，加入不同質(zhì)量的Vc（30、40、50、60、70 mg），在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下反應(yīng)8 h 后，得到五種不同的混合溶液，分別經(jīng)過(guò)醇沉、離心、復(fù)溶、透析、凍干，得到不同Vc 添加量的可德蘭多糖-FA 接枝共聚物。計(jì)算接枝共聚物的得率，并采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定接枝共聚物的接枝率。

1.2.4.3 H2O2的濃度

保持FA 的加入量（200 mg）、Vc 的加入量（50 mg）以及可德蘭多糖溶液的體積與濃度（25 mL，5 mg/mL）不變，添加不同濃度的H2O2溶液（1、3、5、7、9 mol/L），在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下反應(yīng)8 h 后，得到五種不同的混合溶液，分別經(jīng)過(guò)醇沉、離心、復(fù)溶、透析、凍干，得到不同H2O2添加量的可德蘭多糖-FA 接枝共聚物。計(jì)算接枝共聚物的得率，并采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定接枝共聚物的接枝率。

1.2.4.4 反應(yīng)時(shí)間

保持FA 的加入量（200 mg）、Vc 的加入量（50 mg）、H2O2濃度（5 mol/L）以及可德蘭多糖溶液的體積與濃度（25 mL，5 mg/mL）不變，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，經(jīng)過(guò)不同的反應(yīng)時(shí)間（1、4、8、12、16 h），得到五種不同的混合溶液，分別經(jīng)過(guò)醇沉、離心、復(fù)溶、透析、凍干，得到不同反應(yīng)時(shí)間的可德蘭多糖-FA接枝共聚物。計(jì)算接枝共聚物的得率，并采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定接枝共聚物的接枝率。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，可初步確定每組單因素中的最優(yōu)條件。為了得到更高接枝率的可德蘭多糖-FA 接枝共聚物，以接枝率為指標(biāo)，選取每組單因素中最佳水平附近的點(diǎn)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 紫外光譜分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取制得的接枝共聚物溶于去離子水中，配制0.1 mg/mL 的可德蘭多糖-FA接枝共聚物的水溶液，將可德蘭多糖溶于1 mol/L 的NaOH 溶液中，配制0.1 mg/mL 的可德蘭多糖溶液，同時(shí)用無(wú)水乙醇配制0.01 mg/mL 的FA 溶液，在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描分析。

1.2.7 FT-IR 分析

處理前后的可德蘭多糖以及阿魏酸的FT-IR 通過(guò)Nicolet 670 FT-IR 光譜儀進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取1 mg 可德蘭多糖樣品、FA 和可德蘭多糖-FA 接枝共聚物，樣品與溴化鉀按照質(zhì)量比1:100 進(jìn)行混合，壓片，在500～4000 cm-1的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，分辨率為4 °/min。

1.2.8 水溶性的測(cè)定

可德蘭多糖-阿魏酸接枝共聚物水溶性的測(cè)定參照Bai[18]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg 可德蘭多糖-阿魏酸接枝共聚物固體溶解于5 mL 去離子水中，在室溫下攪拌12 h，然后在轉(zhuǎn)速為8000 g 的條件下離心10 min，除去未溶解的可德蘭多糖-阿魏酸接枝共聚物固體，將上清液在105℃下烘干至恒重，按式（1.3）計(jì)算可德蘭多糖-阿魏酸接枝共聚物的水溶性。

其中，m 為上清液中可德蘭多糖-阿魏酸接枝共聚物的質(zhì)量；M 為初始可德蘭多糖-阿魏酸接枝共聚物固體的質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，采用Excel、SPSS和OriginPro 8.5 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的形成機(jī)理

在多糖-酚酸接枝共聚物的制備方法中，Vc/H2O2氧化還原對(duì)因具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[10,19]。在本研究中，利用Vc/H2O2氧化還原對(duì)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，通過(guò)自由基介導(dǎo)的方式，將FA 成功接枝到可德蘭多糖上，其合成機(jī)理如圖1 所示[20]。Vc與H2O2在室溫下反應(yīng)生成Asc·-和·OH。然后，生成的這些自由基（Asc·-和·OH）攻擊可德蘭多糖羥基中的氫原子，從而在可德蘭多糖鏈中形成大分子自由基。最后，F(xiàn)A 分子通過(guò)共價(jià)鍵的方式與可德蘭多糖大分子自由基形成可德蘭多糖-FA 接枝共聚物。

圖1 可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的合成機(jī)理 Fig.1 Synthesis mechanism of FA-grafted curdlan conjugates

2.2 單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 FA 添加量的影響

由圖2 可知，在其他條件保持一定的情況下，接枝共聚物的接枝率隨著FA 添加量的增加而增加，從11.78 mg FA/g 增加到58.87 mg FA/g。這可能是由于隨著FA 添加量的增加，大量的FA 單體分子在可德蘭多糖主鏈附近聚集，與可德蘭多糖發(fā)生反應(yīng)的FA 增多而提高接枝率[21]。當(dāng)FA 添加量大于200 mg 時(shí)，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。在較高的添加量下，接枝率不但沒(méi)有增加，反而逐漸降低。這可能是由于FA 分子在反應(yīng)體系中達(dá)到了飽和，或者是由于FA 添加量的逐漸增加，使反應(yīng)達(dá)到了動(dòng)態(tài)的化學(xué)平衡[22]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)A 添加量的進(jìn)一步增加對(duì)接枝率沒(méi)有產(chǎn)生促進(jìn)作用。同時(shí)，隨著FA添加量的增加，得率逐漸減少。因此，選取FA 添加量為200 mg 作為最佳的反應(yīng)量。

圖2 FA 添加量對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率和得率的影響 Fig.2 Effect of FA amount on grafting rate and yield of FA-grafted curdlan conjugates

2.2.2 Vc 添加量的影響

由圖3 可知，在其他條件不變的情況下，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率隨著Vc 添加量的增加，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在50 mg 時(shí)，接枝率達(dá)到最大，為56.03 mg FA/g。接枝共聚物的得率隨著Vc添加量的增加，也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在50 mg時(shí)，接枝共聚物的得率最大為56.03 mg FA/g。因此，選取Vc 添加量為50 mg 進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 Vc 添加量對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率和得率的影響 Fig.3 Effect of Vc amount on grafting rate and yield of FA-grafted curdlan conjugates

2.2.3 H2O2濃度的影響

由圖4 可知，H2O2的濃度對(duì)接枝共聚物的接枝率和得率均有影響。隨著H2O2濃度的增加，接枝共聚物的接枝率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在濃度為5 mol/L 時(shí)，接枝率達(dá)到最大，為78.87 mg FA/g。然而，當(dāng)H2O2的濃度大于5 mol/L 時(shí)，接枝率會(huì)驟然下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的·OH 存在，會(huì)通過(guò)氧化阻礙接枝反應(yīng)，或者降解可德蘭多糖的分子鏈[23]，從而降低了接枝共聚物的接枝率。此外，接枝共聚物的得率也呈現(xiàn)先緩慢增加后減小的趨勢(shì)。因此，選取H2O2濃度為5 mol/L 作為最佳條件進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 H2O2濃度對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率和得率的影響 Fig.4 Effect of H2O2 concentration on grafting rate and yield of FA-grafted curdlan conjugates

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖5 可知，接枝共聚物的接枝率和得率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12 h 時(shí)，接枝率和得率均達(dá)到最大，分別為90.87 mg FA/g 和34.67%。這說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)，有助于增加接枝共聚物的合成量，但反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)加速反應(yīng)物或接枝產(chǎn)物的降解，從而使得接枝率和得率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[24]。Liu 等[25]曾報(bào)道制備殼聚糖-沒(méi)食子酸接枝共聚物的最佳反應(yīng)時(shí)間為12 h，這與本研究結(jié)果相類(lèi)似。因此，選擇12 h 為最佳的反應(yīng)時(shí)間。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率和得率的影響 Fig.5 Effect of reaction time on grafting rate and yield of FA-grafted curdlan conjugates

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以單因素試驗(yàn)選取的FA添加量、Vc添加量、H2O2濃度和反應(yīng)時(shí)間（分別以A、B、C、D 表示）四個(gè)因素為自變量，以接枝率為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 因素水平表 Table 1 Factor level table

表2 為試驗(yàn)結(jié)果以及極差分析。由表2 中的極差分析可知，對(duì)可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率影響因素從大到小的順序依次為FA 添加量、Vc 添加量、反應(yīng)時(shí)間、H2O2濃度。根據(jù)表2 中接枝率平均數(shù)據(jù)分析可得接枝率最高的因素組合為A3B2C2D2，即FA 添加量為250 mg、Vc 添加量為50 mg、H2O2濃度為5 mol/L、反應(yīng)時(shí)間為12 h。采用最優(yōu)組合A3B2C2D2，進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率為98.62 mg FA/g，得率為40.84%，高于正交表中的最高值（96.85 mg FA/g），因此選擇最優(yōu)組合，制備可德蘭多糖-FA 接枝共聚物。

表2 正交試驗(yàn)與結(jié)果 Table 2 Orthogonal experiment and results

2.4 光譜分析

圖6 和圖7 分別為可德蘭多糖、FA 和可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的紫外光譜和紅外光譜圖。從圖6 可以看出，與原始可德蘭多糖相比，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物分別在295 nm 和312 nm 處出現(xiàn)了與FA 相似的特征吸收峰，這說(shuō)明FA 成功接枝到可德蘭多糖鏈上，這與Woranuch 等[26]的研究結(jié)果相一致。從圖7也可以看出，F(xiàn)A 在1517 cm-1有特征吸收峰[27]，而原始可德蘭則沒(méi)有，與可德蘭多糖的光譜圖相比，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的光譜圖（圖7c）在1514 cm-1處而出現(xiàn)了一個(gè)新的特征吸收峰，歸屬于FA 的C=C芳環(huán)的振動(dòng)，這與紫外光譜的分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步說(shuō)明FA 共價(jià)接枝到可德蘭多糖鏈上。

圖6 可德蘭多糖、FA 和可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的紫外光譜 Fig.6 UV spectra of cotlan polysaccharide,FA and FA-grafted curdlan copolymer

圖7 可德蘭多糖、FA 和可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的紅外光譜 Fig.7 Infrared spectra of curdlan,FA and FA-grafted curdlan copolymer

2.5 水溶性分析

圖8 為可德蘭多糖及其接枝共聚物的水溶性變化情況。從圖中可以看出，經(jīng)堿溶酸中和處理的可德蘭多糖在常溫下表現(xiàn)出一定的水溶性，其水溶性為14.30%。而經(jīng)過(guò)接枝反應(yīng)后，接枝共聚物表現(xiàn)出很好的水溶性，為92.5%，這一結(jié)果表明，接枝反應(yīng)可以大大的改善可德蘭多糖的溶解性。

圖8 可德蘭多糖及其接枝共聚物樣品水溶性分析圖 Fig.8 Water solubility analysis diagram of the samples of curdlan polysaccharide and its graft copolymer

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)Vc/H2O2氧化還原體系，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，能夠成功地將FA 分子接枝到可德蘭多糖的分子鏈上，形成可德蘭多糖-FA 接枝共聚物。

3.2 單因素試驗(yàn)研究表明，F(xiàn)A 添加量為200 mg，Vc添加量為50 mg，H2O2濃度為5 mol/L，反應(yīng)時(shí)間為12 h 時(shí)，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率達(dá)到最高為90.87 mg FA/g，此時(shí)，接枝共聚物的得率為40.84%。

3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物制備的最佳工藝條件為：FA 添加量250 mg，Vc添加量50 mg，H2O2濃度5 mol/L，反應(yīng)時(shí)間12 h，此時(shí)，可德蘭多糖-FA 接枝共聚物的接枝率為98.62 mg FA/g。

3.4 紫外光譜和紅外光譜分析表明，F(xiàn)A 共價(jià)接枝到可德蘭多糖分子鏈上，并且經(jīng)溶解性分析，知接枝共聚反應(yīng)可提高多糖的水溶性。